Metall-begränsad tillväxt av Neisseria gonorrée för karakterisering av metall-lyhörda gener och metall förvärv från Host Ligands

Summary

Vi beskriver här en metod för tillväxt av Neisseria gonorréie i metall-begränsad flytande medium för att underlätta uttrycket av gener för metall upptag. Vi beskriver också nedströms experiment för att karakterisera fenotyp av gonococci odlas under dessa förhållanden. Dessa metoder kan anpassas för att vara lämpliga för karakterisering av metall-lyhörda gener i andra bakterier.

Abstract

Spårmetaller som järn och zink är viktiga näringsämnen kända för att spela nyckelroller i prokaryota processer inklusive genreglering, katalys och proteinstruktur. Metall bindning av värdar leder ofta till metall begränsning för bakterien. Denna begränsning inducerar bakteriellgenuttryck vars proteinprodukter tillåter bakterier att övervinna sin metallbegränsade miljö. Karakterisering av sådana gener är utmanande. Bakterier måste odlas i minutiöst förberedda medier som ger tillräcklig tillgång till näringsmetaller för att möjliggöra bakterietillväxt samtidigt som en metallprofil som bidrar till att uppnå uttryck för ovannämnda gener. Därför måste en känslig balans fastställas för koncentrationerna av dessa metaller. Växande en näringsmässigt kräsen organism som Neisseria gonorrée, som har utvecklats för att överleva endast i den mänskliga värden, lägger till en ytterligare nivå av komplexitet. Här beskriver vi beredningen av ett definierat metallbegränsat medium som är tillräckligt för att möjliggöra gonokocktillväxt och önskat genuttryck. Denna metod gör det möjligt för utredaren att chelate järn och zink från oönskade källor samtidigt komplettera media med definierade källor till järn eller zink, vars beredning beskrivs också. Slutligen beskriver vi tre experiment som använder detta media för att karakterisera proteinprodukter av metallreglerade gonokockgener.

Introduction

Neisseria gonorrée orsakar den vanliga sexuellt överförbara infektion gonorré. Under infektion, patogena Neisseria uttrycka en repertoar av metall-lyhörda gener som tillåter bakterier att övervinna metall begränsning insatser av den mänskliga värd^1,2,3. Spårmetaller som järn och zink spelar nyckelroller i många cellulära processer, såsom bindning till enzymer i katalytiska platser, deltagande i redox reaktioner, och som strukturella faktorer i olika proteiner^4,5. Under metall-begränsade förhållanden, metall-lyhörd loci är förtryckta och deras resulterande proteiner kan hjälpa förvärvet av dessa näringsämnen. Karakterisering av dessa gener och proteiner utgör en unik teknisk utmaning för utredaren. Metalljoner måste undanhållas från bakterier för att inducera transkription av dessa gener från deras inhemska loci, men effektiv kelering av dessa joner från metall-lastade medier kan vara svårt att optimera. De olika metallprofilerna för källvatten och inneboende parti-till-parti-variation⁶ av pulveriserade ingredienser innebär att den mängd kelator som krävs för att ta bort en specifik metall från ett rikt medium varierar mellan olika platser, ingrediensleverantörer och till och med över tiden inom ett enda laboratorium som kemisk inventering ersätts.

För att kringgå denna utmaning beskriver vi utarbetandet av ett definierat medium som behandlas med Chelex-100 harts under beredningen för att avlägsna spårmetaller från lösningen. Detta medium är tillräckligt näringsrikt för att möjliggöra tillväxten av gonokocker, vilket är svårt att odla utanför den mänskliga värden, och gör det möjligt för utredaren att införa en specifik metallprofil genom tillägg av sina egna definierade källor och koncentrationer av Metaller. Metoden för kontrollerad add-back av önskade metaller till utarmade medium ökar experimentell konsistens och möjliggör robusta, reproducerbara experiment oavsett faktorer som vattenkälla och kemiska partinummer. Dessutom kan detta medium distribueras som antingen en vätska eller fast med endast mindre ändringar, vilket gör det ganska mångsidig.

För att visa nyttan av detta medium, beskriver vi ett protokoll för dess användning för gonokock tillväxt och beskriva tre framgångsrika experiment för att karakterisera metall-lyhörda Neisseria gener. Först förbereder vi gonokocker hela cell lysater från metall-utarmade eller kompletterade kulturer och visa varierande nivåer av proteinproduktion från metall-lyhörd loci. Vi beskriver sedan en zink-begränsad tillväxt analys där gonokocktillväxt styrs genom tillskott av specifika, användbara zinkkällor. Slutligen visar vi bindande analyser som visar hela gonokockceller som uttrycker metall-lyhörda ytreceptorer som är bindande för sina respektive metallhaltiga ligands. Framgångsrik ytpresentation av dessa receptorer kräver tillväxt i metallutarmade medium.

Det nuvarande protokollet optimerades speciellt för Neisseria gonorrée, men många andra bakteriella patogener använder metall förvärv strategier under infektion⁷, så detta protokoll kan anpassas för studier av metall homeostas i andra bakterier. Optimera detta media och dessa experimentella protokoll för användning i andra bakterier kommer sannolikt att kräva liten ändring av metall kelator koncentrationer och / eller behandlingstid med Chelex-100, eftersom andra bakterier kan ha något olika metallkrav än gonococcus. Järn och zink är de primära metallerna av oro för de beskrivna undersökningarna, men andra metaller (t.ex. mangan) har visats vara kritiska för bakterier, inklusive Neisseria^8,9,10,11,12. Dessutom har liknande metoder beskrivits för metallkarakteriseringar i eukaryotiskt cellodlingsarbete, vilket också kan övervägas. ¹³

Protocol

1. Beredning av Chelex-behandlade definierade medellagerlösningar Lagerlösning I Kombinera NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) och KH2PO4 (10,9 g) i avjoniserat vatten till en slutlig volym på 1 L. Filtrera sterilisera lösningen och aliquot i 50 ml koniska rör. Förvaras vid -20 °C. Lagerlösning II Kombinera tiamin HCl (0,2 g), tiamin pyrofos…

Representative Results

Ett specifikt definierat medium i avsaknad av spårmetaller för tillväxten av Neisseria gonorréutvecklades och implementerades för karakterisering av metallresponsiva gener och deras genprodukter. I det optimerade protokollet styrs mediets metallprofil genom att lägga till metaller igen efter utredarens gottfinnande, snarare än genom att titrerad kelering av ett metallmål, vilket möjliggör ökad kontroll och konsekvens från labb till labb och experimentera rattexperimen…

Discussion

Tillväxtmedia tjänar en mängd olika roller inom mikrobiologisk forskning. Specialiserade medier används för urval, berikning och olika andra applikationer för många unika typer av studier. En sådan applikation är induktion av metall-lyhörda gener, som vanligtvis sker genom tillägg av en specifik kelator som riktar sig mot en viss metalljon. Denna metod är begränsad, eftersom den mängd kelering som krävs för olika spårmetaller sannolikt kommer att variera på grund av olika vattenkällor som innehåller u…

Materials

125 mL sidearm flasks	Bellco	2578-S0030	Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Open in fume hood
3MM Paper	GE Health	3030-6461	Called "filter paper" in text
Agarose	Biolone	BIO-41025	Powder
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434	Powder
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Powder
Blotting grade blocker	Bio-Rad	170-6404	Nonfat dry milk
Bovine serum albumin	Roche	3116964001	Powder
Bovine transferrin	Sigma-Aldrich	T1428	Powder
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	Powder
Calcium pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731	Powder
Calprotectin	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin	Bio-Rad	142-2832	Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab	Puritan	25-806	Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Powder
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Powder
Dialysis cassette	Thermo	66380	Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus	Schleicher & Schwell	10484138	Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol	Koptec	V1016	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	F7134	Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	F1143	Irritant, do not inhale
GC medium base	Difco	228950	Powder, already contains agar
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Powder
HEPES	Fisher	L-15694	Powder
Human transferrin	Sigma-Aldrich	T2030	Powder
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	Powder
Klett colorimeter	Manostat	37012-0000	Uses color transmission to assess culture density
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627	Powder
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Powder
L-asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A8381	Powder
L-aspartate	Sigma-Aldrich	A9256	Powder
L-cysteine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C1276	Powder
L-cystine	Sigma-Aldrich	C8755	Powder
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	Powder
L-histidine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	H8125	Powder
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752	Powder
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000	Powder
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501	Powder
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625	Powder
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126	Powder
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380	Powder
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500	Powder
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625	Powder
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254	Powder
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754	Powder
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500	Powder
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Powder
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose	GE Health	10600002	Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	60356	Powder
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Powder
Potassium sulfate	Sigma-Aldrich	P0772	Powder
Potato starch	Sigma-Aldrich	S4251	Powder
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G4251	Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder
Sodium chloride	VWR	470302	Powder
Sodium citrate	Fisher	S279	Powder
Sodium hydroxide	Acros Organics	383040010	Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625	Powder
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Also called cocarboxylase
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Powder
Tris	VWR	497	Powder
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750	Powder
Zinc sulfte heptahydrate	Sigma-Aldrich	204986	Irritant, do not inhale