De belangrijkste bekken ganglia bevatten parasympathische en sympathische neuronen die bekkenorganen innervate. Hier beschrijven we een dissectie methode en bieden schema’s voor de identificatie van deze ganglia en hun bijbehorende zenuwen. Deze methoden kunnen worden toegepast op experimentele manipulatie van deze ganglia in vivo of verwijdering post-mortem voor verder onderzoek.
De bilaterale belangrijkste bekken ganglia (MPG; synoniem, bekken ganglia) zijn de primaire bron van postganglionic sympathieke en parasympathische neuronen innervating bekkenorganen van knaagdieren; de functioneel gelijkwaardige structuur bij mensen is de inferieure hypogastrische plexus. De belangrijkste bekken ganglia bieden ook de route waarmee lumbale en sacrale sensorische axonen de bekkenorganen bereiken. Deze complexe, gemengde ganglia kan een uitdaging blijken te identificeren en te ontleden voor verdere experimentele studie van normale autonome mechanismen of om preklinische modellen van ziekte, letsel of viscerale pijn vast te stellen. Hier beschrijven we een protocol om toegang te krijgen tot deze ganglia en hun bijbehorende zenuwwerken. Wij voorzien dit protocol van schema’s voor zowel mannelijke als vrouwelijke ratten, omdat de ganglion grootte en oriëntatiepunten voor identificatie verschillen tussen geslachten. Het protocol beschrijft het verwijderen van het ganglion voor in vitro studies, maar deze methode kan worden geïntegreerd in een chirurgisch herstelprotocol voor experimentele interventies (bijvoorbeeld zenuwbreker, zenuwresectie) of voor het in kaart brengen van neuronale circuits (bijvoorbeeld door micro-injectie van neurale tracers). We tonen ook de primaire structuren van de ganglion en de bijbehorende zenuwen onmiddellijk na dissectie en na immunohistochemische vlekken.
De rat is een van de best gekarakteriseerde soorten die worden gebruikt in de studie van de bekkenorgaanfysiologie en anatomie. Hoewel er uitstekende middelen bestaan voor beschrijvingen van deze organen1,2, geven ze over het algemeen geen informatie over de gerelateerde neurale structuren of doen ze dit bij onvoldoende resolutie om een experimentele studie te begeleiden. Zoals hieronder beschreven, de organisatie van de autonome ganglia die bekkenorgaanfunctie reguleren is heel anders dan de rest van het autonome zenuwstelsel, waardoor het moeilijk is om bekkeninnervation-kenmerken nauwkeurig af te leiden van neuroanatomische informatie die beschikbaar is voor andere autonome ganglia. Dit tekort aan middelen om onderzoekers te begeleiden het invoeren van dit gebied kan hebben vertraagd onderzoek naar neurale regulatie van bekkenorganen. Hier beschrijven we protocollen voor de toegang tot deze regio van het zenuwstelsel voor verdere in vitro studies of experimentele interventie.
De bilaterale belangrijkste bekkenganglia (MPG; synoniemen: bekken ganglia; paracervicale ganglia [vrouw]; Frankenhäuser’s ganglion [vrouwelijk]) zijn de primaire bron van postganglionic sympathieke en parasympathische neuronen innervating bekkenorganen van knaagdieren; de inferieure hypogastrische plexus omvat de gelijkwaardige neuronale structuur bij mensen3,4,5,6. Sensorische projecties van lumbale en sacrale rugwortel ganglia reizen ook via de MPG om de bekkenorganen te bereiken. Daarom is het begrijpen van de neurale circuits en biologie van de MPG van cruciaal belang voor preklinische studies over een groot aantal klinische aandoeningen met betrekking tot de ontwikkeling en volwassen functie van bekkenorganen. Verschillende uitstekende beschrijvingen van knaagdier MPG zijn gepubliceerd7,8, maar onze ervaring is dat in het algemeen deze beschrijvingen niet altijd voldoende begeleiding bieden om praktisch te informeren over een experimentele dissectie of manipulatie van deze structuren wanneer herstel van het dier nodig is. Bovendien richten de meeste MPG-studies zich op mannelijke ratten. Bij vrouwelijke ratten, de MPG zijn kleiner9 en hebben verschillende anatomische oriëntatiepunten, en daarom vereisen een duidelijk op maat gemaakte gids voor visualisatie en dissectie.
Sympathische en parasympathische paden onderscheiden zich door hun anatomie, met name de locatie van hun preganglionic neuronen, met sympathische paden met preganglionic neuronen in het thoraco-lumbale ruggenmerg en de parasympathische preganglionic neuronen gelegen in de hersenstam (craniale zenuwprojecties) en sacrale ruggenmerg. In de meeste andere regio’s van het autonome systeem, hun doel ganglion neuronen bevinden zich in verschillende sympathieke of parasympathische ganglia. Echter, de MPG zijn ongebruikelijk in wordt gemengd sympathische parasympathische ganglia, en daarom op een macroscopische schaal zijn sites van convergentie van preganglionic axonen van zowel thoraco-lumbale en sacrale spinale regio’s. We hebben daarom in onze protocollen de locatie en beschrijving opgenomen van deze primaire zenuwwerken die elk ruggenmerggebied verbinden met de MPG, waardoor experimentele analyse of afzonderlijke manipulatie van deze neurale componenten wordt vergemakkelijkt. We merken ook op voor lezers die deze ganglia specifiek vergelijken tussen soorten, dat bij knaagdieren de spinale preganglionische neuronen die ‘functioneel sacraal’ zijn, bijvoorbeeld actief zijn en vereist zijn tijdens micturition, ontlasting en peniserectie, zich op het ruggenmergniveau L6-S1 bevinden in plaats van uitsluitend in sacrale segmenten10; Ook L6 en S1 dorsale wortel ganglia zorgen voor de belangrijkste ‘sacrale’ zintuiglijke input voor bekkenorganen. Bij knaagdieren is sensorische en preganglionische input van meer rostral neurale circuits geconcentreerd in spinale niveaus L1 en L210.
Hier beschrijven we een protocol om toegang te krijgen tot de MPG en de bijbehorende zenuwwerken bij mannelijke en vrouwelijke ratten, en ondersteunen dit met schema’s om specifieke oriëntatiepunten te illustreren. Dit protocol begeleidt chirurgische toegang tot deze structuren in een experimentele context van het verwijderen van het weefsel voor in vitro studies, bijvoorbeeld het isoleren van MPG-neuronen voor moleculaire karakterisering of primaire cultuur. Het kan ook worden aangepast aan MPG verwijdering na intracardiale perfusie met fixatieve, hoewel dit een moeilijkere dissectie omdat het neurale weefsel wordt moeilijker te visualiseren wanneer de aangrenzende weefsels zijn verstoken van bloed. Dit protocol kan ook worden geïntegreerd in een chirurgische instelling voor experimentele interventie van deze zenuwbanen (bijvoorbeeld zenuwresectie, micro-injectie van neurale tracers). Deze soorten dissecties worden steeds belangrijker voor het groeiende gebied van de bio-elektronische geneeskunde, waar nieuwe doelen en benaderingen voor neuromodulatie voor de behandeling van klinische aandoeningen van de bekkeningewanden worden ontwikkeld11. We presenteren eerst het volledige protocol voor mannelijke ratten, daarna een replica van het protocol dat speciaal is afgestemd op vrouwelijke ratten.
Neurale controle van de bekkenorganen wordt bemiddeld door complexe trajecten, waaronder somatische, parasympathische, sympathische en viscerale zintuiglijke componenten14,15,16,17. De meeste van deze trajecten komen voort uit of gaan door de MPG. De hier beschreven dissectieprotocollen bieden een inleiding tot MPG-anatomie, de bijbehorende bijbehorende zenuwen en nabijgelegen macroscopische anatomische oriëntatiepunten; de laatste worden geïllustreerd door anatomische schema’s. Andere benaderingen van MPG dissectie kan ook succesvol zijn, maar we vinden de hier beschreven robuust en geschikt voor een onderzoeker nieuw op dit gebied van het zenuwstelsel.
De meest kritische aspecten van het protocol zijn de juiste identificatie van elke grote zenuw en de volledige verwijdering van MPG weefsel. Met een zorgvuldige weergave en behandeling van de weefsels kunnen MPG-weefsels worden verwijderd voor anatomische, moleculaire en elektrofysiologische in vitro studies18,19,20,21,22. Het protocol kan ook worden aangepast voor in vivo experimentele manipulatie23,24,25, erop wijzend dat in dit geval, grote zorg moet worden genomen om het contact met de primaire zenuwen in verband met de ganglion of schade in de buurt vasculatuur te minimaliseren. Als het experiment selectieve denervation vereist door onderbreking van een of meer zenuwen, wordt het aanbevolen om de afgehakte zenuw te ligateren om reinnervation en verwoping van analyses te voorkomen. Dit dissectieprotocol kan ook worden gebruikt voor de muis, waarbij er ook een MPG met vergelijkbare functie26,27,28is.
Voor neuroanatomische studies wordt het beste behoud van antigenen en weefselstructuur verkregen door de MPG te ontleden van een verdoofd dier dat transcardiotisch is geperfundeerd met histologische fixatief dat geschikt is voor het experiment29; echter, identificatie van de ganglion en zenuwstructuren zijn moeilijker na dit proces, als het weefsel kleuring verloren gaat. Het wordt aanbevolen om bedreven te worden in het identificeren en ontleden van de ganglion van niet-geperfundeerde dieren voordat u deze dissectie na perfusie probeert. Evenzo wordt aanbevolen om eerst bedreven te worden in de dissectie bij mannen, omdat voor dieren van gelijke leeftijd en lichaamsgrootte, de MPG en de bijbehorende zenuwen zijn veel kleiner bij vrouwen.
Om te valideren dat het weefsel verwijderd is inderdaad de MPG, de onderzoeker wordt eerst geadviseerd om de locatie en kenmerken van elke primaire zenuw te controleren. Veel dissectoren vinden de bekkenzenuw en holle zenuw het gemakkelijkst te identificeren in situ; de hypogastrische en accessoire zenuwen zijn gevoeliger en moeilijker te onderscheiden van het omliggende weefsel. Als deze zenuwen niet meer beschikbaar zijn vanwege problemen tijdens de dissectie, of als er onzekerheid is over hun structuur, wordt aanbevolen dat de eerste MPG dissecties worden gekenmerkt met conventionele histologie (om de aanwezigheid van neuronale cellichamen te bevestigen8) en ten tweede met immunohistochemie (om vast te stellen dat zowel cholinerge als noradrenergic neuronen aanwezig zijn30,31) ( Figuur3). Om de juiste identificatie van de belangrijkste zenuwen te valideren, worden de holle zenuwen gemakkelijk geïdentificeerd door hun hoge dichtheid van neuronale cellichamen in hun eerste gedeelte dicht bij de MPG; de meeste van deze neuronen uitdrukken markers van cholinerge, nitrergic neuronen32,33. De bekken-, hypogastrische en accessoire zenuwen hebben zeer weinig neuronale cel lichamen34.
Er zijn verschillende veel voorkomende valkuilen in het uitvoeren van deze dissectie. Als beginnende dissectoren problemen hebben met het vinden van een van de belangrijkste zenuwen of de MPG, worden ze aangemoedigd om terug te keren naar de stappen die de belangrijkste oriëntatiepunten beschrijven. Het is heel gebruikelijk om zo gericht te worden op het vinden van de microstructuren dat men de macroscopische context uit het oog verliest. Meestal, beginnende dissectoren ofwel te veel rostral bewegen in hun dissectie site of blijven te ‘oppervlakkig’-dat wil zeggen, te dicht bij de ventrale opening van de buik, in plaats van het onderzoeken van diepere (dat wil zeggen, meer dorsale) structuren. Een veel voorkomend probleem tijdens de dissectie is schade aan de vasculatuur tijdens dissectie. Als het bloeden begint, houd voorzichtig een katoen-getipte applicator over de bron tot het bloeden stopt, dan spoel het gebied royaal met zout voordat recommencing dissectie. Het is mogelijk dat de MPG niet bruikbaar zal zijn voor experimenten als ze besmet zijn met te veel bloed of als de dissectie te lang wordt uitgesteld in afwachting van het bloeden om te stoppen. Een andere veel voorkomende dissectie fout is schade aan de capsule van de prostaatklier die aanzienlijk afbreuk doet aan de MPG visualisatie en verwijdering. Deze capsule is een zeer delicate structuur die gemakkelijk wordt doorboord tijdens het verwijderen van het vet uit de laterale wand van de prostaat, zelfs als alleen een katoen-getipte applicator wordt gebruikt. Ten slotte worden de belangrijkste zenuwen in verband met de MPG gemakkelijk beschadigd tijdens het proces van het identificeren van elk en vervolgens tijdens het verwijderen van de MPG. Dissectoren worden aangemoedigd om een routine te ontwikkelen waarbij elke zenuw op zijn beurt, in een bepaalde volgorde, wordt geïsoleerd, zodat er minder kans op verwarring is tijdens de laatste stappen van ganglion verwijdering.
Deze dissectie heeft niet getracht om elk van de componenten van het accessoire zenuwen te traceren naar specifieke organen, of om elk van de vele microganglia die liggen op verschillende punten tussen de bekken ganglia en de bekkenorganen8te identificeren. Deze zijn vrij moeilijk te visualiseren in vivo zonder gebruik te maken van specifieke vlekken; echter, ze kunnen worden verwijderd door het volgen van elk van de zenuwbanen in de richting van de organen, en gebruik te maken van specifieke neurale vlekken post hoc om ganglion locatie te bepalen. Deze microganglia, hoewel bestaande uit slechts een klein deel van de neuronale bevolking in vergelijking met de MPG, kan specifieke soorten input te bieden aan de organen waaraan ze het meest dicht gelegen. We merken hier een beperking op het gebied dat noch deze microganglia, noch veel van de kleine zenuwwerken verlaten van de MPG om te reizen naar bekkenorganen nog in grote lijnen geaccepteerde namen. Bovendien is een soortgelijke gedetailleerde studie van microganglia nog niet uitgevoerd bij vrouwelijke ratten.
Samengevat, het protocol en schema’s hier bieden onderzoekers met instrumenten om de primaire structuren die de autonome zenuwtoevoer naar de bekkenorganen, evenals de belangrijkste perifere leidingen van sensorische zenuwen van lumbosacrale dorsale wortel te bestuderen ganglia die via de MPG naar bekkenorganen reizen.
The authors have nothing to disclose.
Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het Bureau van de Directeur, National Institutes of Health, Stimuleren van perifere activiteit om te verlichten Voorwaarden (SPARC) Programma, Award Number OT2OD023872. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de Nationale Instituten voor Volksgezondheid. Dr. Bertrand’s fellowship in het laboratorium van Dr. Keast werd gefinancierd door: Het Universitair Ziekenhuis van Nîmes, de faculteit geneeskunde van Montpellier-Nîmes, De Vereniging Française de Chirurgie (AFC), De Société Interdisciplinaire Franstalige d’UroDynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) en het People Programme (Marie Curie Actions) van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (KP7/2007-2013) in het kader van REA-subsidieovereenkomst GEEN PCOFUND-GA-2013-609102, via het PRESTIGE-programma gecoördineerd door Campus Campus Frankrijk.
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
LED light source | Schott | KL 1600 | |
Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |