Характеристика в пробирке Дифференциация первичных кератиноцитов человека с помощью анализа РНК-Сек

Summary

Представлена здесь пошаговая процедура для дифференциации в пробирке первичных кератиноцитов человека путем ингибирования контакта с последующим характеристикой на молекулярном уровне анализом РНК-сек.

Abstract

Первичные кератиноциты человека часто используются в качестве моделей in vitro для исследований по эпидермальной дифференциации и сопутствующим заболеваниям. Сообщалось о методах дифференциации кератиноцитов в пробирке, обучаемых двумерными (2D) подводными способами с использованием различных условий индукции. Описана здесь процедура 2D в пробирке метод дифференциации кератиноцитов путем ингибирования контакта и последующей молекулярной характеристики РНК-сек. Короче говоря, кератиноциты выращиваются в определенных кератиноцитов среды дополняется факторами роста, пока они полностью стечены. Дифференциация вызвана тесными контактами между кератиноцитами и в дальнейшем стимулируется за счет исключения факторов роста в среде. Используя анализы РНК-сек, показано, что оба дифференцированных кератиноцита обладают различными молекулярными сигнатурами во время дифференциации и 2) динамический шаблон экспрессии генов в значительной степени напоминает клетки во время эпидермального расслоения. Что касается сравнения с нормальной дифференциацией кератиноцитов, то кератиноциты, несущие мутации транскрипционные факторы p63, обладают измененной морфологией и молекулярными сигнатурами, в соответствии с их дефектами дифференциации. В заключение, этот протокол подробно шаги для 2D в пробирке кератиноцитов дифференциации и его молекулярной характеристики, с акцентом на биоинформатический анализ данных РНК-сек. Поскольку процедуры извлечения РНК и РНК-сек хорошо документированы, это не является фокусом этого протокола. Экспериментальная процедура дифференциации кератиноцитов в пробирке и биоинформатического анализа трубопровода может быть использована для изучения молекулярных событий во время эпидермальной дифференциации в здоровых и больных кератиноцитах.

Introduction

Первичные кератиноциты человека, полученные из кожи человека, часто используются в качестве клеточной модели для изучения^{биологии эпидермиса 1,2,3,4.} Стратификация эпидермиса может быть смоделирована с помощью дифференциации кератиноцитов, либо в 2D погруженном монослойном моде, либо в 3D органотипической^{модели 2,3,5,6,7.} Хотя 3D-модели становятся все более важными для оценки эпидермальной структуры и функции, 2D модели дифференциации по-прежнему широко используются, в связи с их удобством и возможностью генерировать большое количество клеток для анализа.

Различные условия были применены для индуцирования дифференциации кератиноцитов в 2D, в том числе добавление сыворотки, высокая концентрация кальция, более низкая температура и ингибирование рецепторов^{эпидермального фактора роста 2,3}. Каждый из этих методов был проверен рядом генов маркера дифференциации кератиноцитов и показал свою эффективность в оценке дифференциации кератиноцитов, в том числе в патологических условиях. Тем не менее, эти условия индукции также показывают различия в эффективности их дифференциации и кинетики, когда конкретные панели^{маркерных генов рассматриваются 2,3.}

Один из этих методов включает в себя ингибирование контакта кератиноцитов и истощение факторов роста в среде^{культуры 8.} Было показано, что кератиноциты могут дифференцироваться спонтанно, когда клетки достигают полной плотности.  Исключение факторов роста в среде культуры может еще больше усилить дифференциацию. Метод объединения ингибирования контакта и истощения факторов роста было показано для создания дифференцированных кератиноцитов с генными экспрессионными моделями, похожими на нормальный стратифицированный эпидермис при использовании нескольких эпидермальных^{маркеров 3}, предполагая, что эта модель подходит для изучения нормальной дифференциации кератиноцитов. Недавно, два всеобъемлющих анализа экспрессии генов дифференциации кератиноцитов с помощью этой модели были^{зарегистрированы 9,10}. Исследователи проверили эту модель на молекулярном уровне и показали, что она может быть использована для изучения нормальной и больной дифференциации кератиноцитов.

Этот протокол описывает процедуру метода дифференциации in vitro и молекулярного анализа дифференцированных клеток с использованием РНК-сек. Он также иллюстрирует характеристику транскриптома клеток на день дифференциации 0 (стадия распространения), день 2, день 4 и день 7 (ранняя, средняя и поздняя дифференциация, соответственно). Показано, что дифференцированные кератиноциты отображают модели экспрессии генов, которые во многом напоминают клетки во время эпидермального расслоения. Чтобы изучить, может ли этот метод быть использован для изучения патологии кожи, мы применили тот же экспериментальный и анализ трубопровода для исследования кератиноцитов проведения мутаций транскрипционного фактора p63, которые являются производными от пациентов с эктродактически, эктодермальной дисплазии и расщелины губы / неба (EEC)^{синдром 11,12}. Этот протокол фокусируется на дифференциации кератиноцитов в пробирке, а также последующем биоинформатическое анализ РНК-сек. Другие шаги в полной процедуре, такие как экстракция РНК, подготовка образца РНК-сек и строительство библиотеки, хорошо документированы и могут быть легко соблюдены, особенно при использовании многих широко используемых коммерческих комплектов. Таким образом, эти шаги лишь кратко описаны в протоколе. Данные показывают, что этот трубопровод подходит для изучения молекулярных явлений во время эпидермальной дифференциации в здоровых и больных кератиноцитах.

Protocol

Биопсия кожи была взята из ствола здоровых добровольцев или пациентов с мутациями p63, чтобы создать первичную культуру кератиноцитов. Все процедуры, касающиеся создания первичных кератиноцитов человека, были одобрены комитетом по этике Медицинского центра Университета Радбуда в Нейм…

Representative Results

Нормальная дифференциация кератиноцитов и анализ РНК-секВ этом эксперименте для дифференциации и анализа РНК-сек использовались линии кератиноцитов, полученные от пяти особей. На рисунке 1 обобщается экспериментальная процедура дифференциации и результат…

Discussion

В этой работе описывается метод индуцирования дифференциации кератиноцитов человека и последующая характеристика с использованием анализа РНК-сек. В текущей литературе, многие исследования по дифференциации кератиноцитов человека использовать два других метода, с высокой концентр?…

Materials

Bioanalyzer 2100	Agilent	G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE)	Lonza		Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system	Bio-Rad		qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Epidermal Growth Factor (EGF)	Lonza		Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98%	Sigma-Aldrich	E9508
High Sensitivity DNA chips	Agilent	5067-4626
Hydrocortison	Lonza		Part of the bulletKit
Insulin	Lonza		Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit	BioRad	170-8886
iScript cDNA synthesis	Bio rad	1708890
KAPA Library Quant Kit	Roche	07960255001	Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase	Roche	KK8540	RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit	Lonza	192060
Nanodrop	deNovix	DS-11 FX (model)	Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24	Illumnia	NOVA-514103	6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513