आरएनए-सेक्यू विश्लेषण द्वारा मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव का लक्षण वर्णन
Summary
यहां प्रस्तुत संपर्क अवरोध द्वारा मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव के लिए एक स्टेपवाइज प्रक्रिया है जिसके बाद आरएनए-सेक्यू विश्लेषण द्वारा आणविक स्तर पर लक्षण वर्णन किया जाता है।
Abstract
मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स का उपयोग अक्सर एपिडर्मल भेदभाव और संबंधित बीमारियों पर अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में किया जाता है। विभिन्न प्रेरण स्थितियों का उपयोग करके दो-आयामी (2डी) जलमग्न शिष्टाचार में सुसंस्कृत केराटिनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव के लिए विधियों की सूचना दी गई है। यहां वर्णित संपर्क अवरोध और बाद में आरएनए-एसईक्यू द्वारा आणविक लक्षण वर्णन द्वारा 2डी इन विट्रो केराटिनोसिटे भेदभाव विधि के लिए एक प्रक्रिया है। संक्षेप में, केराटिनोसाइट्स को परिभाषित केराटिनसाइट माध्यम में विकास कारकों के साथ पूरक किया जाता है जब तक कि वे पूरी तरह से कॉन्फ्लोटेंट न हों। भेदभाव केराटिनोसाइट्स के बीच घनिष्ठ संपर्कों से प्रेरित होता है और माध्यम में विकास कारकों को छोड़कर आगे उत्तेजित होता है। आरएनए-सेक्यू विश्लेषणों का उपयोग करके, यह दिखाया गया है कि दोनों 1) विभेदित केराटिनोसाइट्स विभेदन के दौरान अलग-अलग आणविक हस्ताक्षर प्रदर्शित करते हैं और 2) गतिशील जीन अभिव्यक्ति पैटर्न काफी हद तक एपिडर्मल स्तरीकरण के दौरान कोशिकाओं जैसा दिखता है। सामान्य केराटिनोसिटे भेदभाव की तुलना के लिए, ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर पी 63 के उत्परिवर्तनों को ले जाने वाले केराटिनोसाइट्स ने अपने भेदभाव दोषों के अनुरूप आकृति विज्ञान और आणविक हस्ताक्षरों को बदल दिया। अंत में, यह प्रोटोकॉल आरएनए-सेक्यू डेटा के बायोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषण पर जोर देने के साथ 2डी इन विट्रो केराटिनोसाइट भेदभाव और इसके आणविक लक्षण वर्णन के लिए कदमों का विवरण देता है। क्योंकि आरएनए निष्कर्षण और आरएनए-एसईक्यू प्रक्रियाओं को अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, यह इस प्रोटोकॉल का ध्यान केंद्रित नहीं है। इन विट्रो केराटिनोसिटे विभेदन और बायोइंफॉर्मेटिक विश्लेषण पाइपलाइन की प्रायोगिक प्रक्रिया का उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त केराटिनोसाइट्स में एपिडर्मल भेदभाव के दौरान आणविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
मानव त्वचा से प्राप्त मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स का उपयोग अक्सर एपिडर्मिस 1,2, 3 ,4के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक सेलुलर मॉडल के रूप में कियाजाताहै। एपिडर्मिस के स्तरीकरण को केराटिनोसिटे भेदभाव द्वारा मॉडलिंग किया जा सकता है, या तो 2D जलमग्न मोनोलेयर फैशन या 3 डी एयर-लिफ्ट ऑर्गेनोटिपिकमॉडल2,3,5,6,7में। यद्यपि एपिडर्मल संरचना और कार्य का आकलन करने के लिए 3 डी मॉडल तेजी से महत्वपूर्ण हो गए हैं, लेकिन उनकी सुविधा और विश्लेषण के लिए बड़ी संख्या में कोशिकाओं को उत्पन्न करने की संभावना के कारण 2डी भेदभाव मॉडल अभी भी व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं।
सीरम के अलावा, कैल्शियम की उच्च एकाग्रता, कम तापमान और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर्स 2,3के अवरोध सहित2डीमें केराटिनोसिटे भेदभाव को प्रेरित करने के लिए विभिन्न शर्तें लागू की गई हैं। इन तरीकों में से प्रत्येक को कई केराटिनोसिटे विभेदन मार्कर जीन द्वारा मान्य किया गया है और रोग ों की स्थिति सहित केराटिनोसिटे भेदभाव का आकलन करने में प्रभावी दिखाया गया है। हालांकि , इन इंडक्शन स्थितियां उनकी भेदभाव दक्षता और काइनेटिक्स में भी अंतर दिखाती हैं जब मार्कर जीन के विशिष्ट पैनलों की जांच की जाती है2,3.
इनमें से एक पद्धति में संस्कृति माध्यम8में केराटिनोसिट संपर्क अवरोध और विकास कारकों की कमी शामिल है । यह दिखाया गया है कि जब कोशिकाएं पूर्ण घनत्व तक पहुंचती हैं तो केराटिनोसाइट्स अनायास अंतर कर सकते हैं। संस्कृति माध्यम में विकास कारकों को छोड़कर भेदभाव को और बढ़ा सकते हैं । संपर्क अवरोध और घटते विकास कारकों के संयोजन की विधि को कई एपिडर्मल मार्कर3का उपयोग करते समय सामान्य स्तरीकृत एपिडर्मिस के समान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ विभेदित केराटिनोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है, यह सुझाव देता है कि यह मॉडल सामान्य केराटिनोसिटे भेदभाव का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। हाल ही में, इस मॉडल का उपयोग करके केराटिनोसिटे भेदभाव के दो व्यापक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण9,10की सूचना दी गई है । शोधकर्ताओं ने आणविक स्तर पर इस मॉडल को मान्य किया और दिखाया कि इसका उपयोग सामान्य और रोगग्रस्त केराटिनसाइट भेदभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल आरएनए-एसईक्यू का उपयोग करके इन विट्रो भेदभाव विधि और विभेदित कोशिकाओं के आणविक विश्लेषण की प्रक्रिया का वर्णन करता है। यह भेदभाव दिवस 0 (प्रसार चरण), 2 दिन, 4 दिन, और 7 दिन (क्रमशः प्रारंभिक, मध्यम और देर से भेदभाव) पर कोशिकाओं के प्रतिलिपिकरण के लक्षण वर्णन भी करता है। यह दिखाया गया है कि विभेदित केराटिनोसाइट्स जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित करते हैं जो काफी हद तक एपिडर्मल स्तरीकरण के दौरान कोशिकाओं के समान होते हैं। यह जांचने के लिए कि क्या इस विधि का उपयोग त्वचा विकृति का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, हमने ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर p63 के म्यूटेशन को ले जाने वाले केराटिनोसाइट्स की जांच करने के लिए एक ही प्रयोगात्मक और विश्लेषण पाइपलाइन लागू की जो ectrodactyly, एक्टोडर्मल डिस्प्लासिया और फांक होंठ/तालू (ईईसी) सिंड्रोम11,12के साथ रोगियों से प्राप्त होते हैं । यह प्रोटोकॉल केराटिनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव के साथ-साथ आरएनए-एसईक्यू के बाद के बायोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषण पर केंद्रित है। आरएनए निष्कर्षण, आरएनए-सेक्यू नमूना तैयारी और पुस्तकालय निर्माण जैसी पूरी प्रक्रिया में अन्य कदम अच्छी तरह से प्रलेखित हैं और आसानी से पालन किया जा सकता है, खासकर जब कई आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक किट का उपयोग करते हैं। इसलिए, इन कदमों को प्रोटोकॉल में केवल संक्षेप में वर्णित किया गया है। आंकड़ों से पता चलता है कि यह पाइपलाइन स्वस्थ और रोगग्रस्त केराटिनोसाइट्स में एपिडर्मल भेदभाव के दौरान आणविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह काम आरएनए-सेक्यू विश्लेषणों का उपयोग करके मानव केराटिनोसिटे भेदभाव और बाद में लक्षण वर्णन को प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। वर्तमान साहित्य में, मानव केराटिनोसिटे भेदभाव पर कई अध्यय?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) द्वारा समर्थित किया गया था । (NWO/ALW/ओपन प्रतियोगिता/ALWOP ३७६, H.Z., J.G.A.S.); राबोद विश्वविद्यालय फैलोशिप (एच जेड); और चीनी छात्रवृत्ति परिषद अनुदान 201406330059 (जेक्यू) ।
Materials
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
| iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
| KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
| KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
| NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
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