Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

Summary

Qui è presentata una procedura graduale per la differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani per inibizione del contatto seguita dalla caratterizzazione a livello molecolare mediante analisi RNA-seq.

Abstract

I cheratinociti primari umani sono spesso usati come modelli in vitro per studi sulla differenziazione epidermica e sulle malattie correlate. Sono stati riportati metodi per la differenziazione in vitro dei cheratinociti coltivati in modo sommerso bidimensionale (2D) utilizzando varie condizioni di induzione. Qui descritta è una procedura per il metodo di differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D per inibizione del contatto e successiva caratterizzazione molecolare da parte dell’RNA-seq. In breve, i cheratinociti vengono coltivati in un mezzo cheratinocita definito integrato con fattori di crescita fino a quando non sono completamente confluenti. La differenziazione è indotta da stretti contatti tra i cheratinociti e ulteriormente stimolata escludendo i fattori di crescita nel mezzo. Usando analisi RNA-seq, è dimostrato che entrambi 1) cheratinociti differenziati mostrano firme molecolari distinte durante la differenziazione e 2) il modello di espressione genica dinamica assomiglia in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per quanto riguarda il confronto con la normale differenziazione dei cheratinociti, i cheratinociti che trasportano mutazioni del fattore di trascrizione p63 mostrano morfologia alterata e firme molecolari, coerenti con i loro difetti di differenziazione. In conclusione, questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per la differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D e la sua caratterizzazione molecolare, con particolare attenzione all’analisi bioinformatica dei dati RNA-seq. Poiché l’estrazione dell’RNA e le procedure RNA-seq sono state ben documentate, non è al centro di questo protocollo. La procedura sperimentale di differenziazione dei cheratinociti in vitro e di pipeline di analisi bioinformatica può essere utilizzata per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

Introduction

I cheratinociti primari umani derivati dalla pelle umana sono spesso usati come modello cellulare per studiare la biologia dell’epidermide^1,2,3,4. La stratificazione dell’epidermide può essere modellata dalla differenziazione dei cheratinociti, sia in modo monostrato sommerso 2D che nel modello organotipico di sollevamento dell’aria 3D^2,3,5,6,7. Sebbene i modelli 3D siano diventati sempre più importanti per valutare la struttura e la funzione epidermica, i modelli di differenziazione 2D sono ancora ampiamente utilizzati, a causa della loro convenienza e della possibilità di generare un gran numero di cellule per le analisi.

Varie condizioni sono state applicate per indurre la differenziazione dei cheratinociti in 2D, tra cui l’aggiunta di siero, alta concentrazione di calcio, temperatura più bassa e inibizione dei recettori del fattore di crescita epidermico^2,3. Ognuno di questi metodi è stato convalidato da una serie di geni marcatori di differenziazione dei cheratinociti e si è dimostrato efficace nel valutare la differenziazione dei cheratinociti, anche in condizioni patologiche. Tuttavia, queste condizioni di induzione mostrano anche differenze nella loro efficienza di differenziazione e cinetica quando vengono esaminati pannelli specifici^{di geni marcatori 2,3}.

Uno di questi metodi prevede l’inibizione del contatto dei cheratinociti e l’esaurimento dei fattori di crescita nel mezzo^{di coltura 8}. È stato dimostrato che i cheratinociti possono differenziarsi spontaneamente quando le cellule raggiungono la piena densità.  Escludere i fattori di crescita nel mezzo di coltura può migliorare ulteriormente la differenziazione. Il metodo che combina l’inibizione del contatto e l’esaurimento dei fattori di crescita ha dimostrato di generare cheratinociti differenziati con modelli di espressione genica simili alla normale epidermide stratificata quando si utilizzano diversi marcatori epidermici³, suggerendo che questo modello è adatto per studiare la normale differenziazione dei cheratinociti. Recentemente, sono state riportate due analisi complete dell’espressione genica della differenziazione dei cheratinociti^{utilizzando questo modello 9,10}. I ricercatori hanno convalidato questo modello a livello molecolare e hanno dimostrato che può essere utilizzato per studiare la differenziazione dei cheratinociti normale e masabile.

Questo protocollo descrive la procedura per il metodo di differenziazione in vitro e l’analisi molecolare di cellule differenziate utilizzando RNA-seq. Illustra anche la caratterizzazione del trascritoma delle cellule nel giorno di differenziazione 0 (fase di proliferazione), giorno 2, giorno 4 e giorno 7 (differenziazione precoce, media e tardiva, rispettivamente). È dimostrato che i cheratinociti differenziati mostrano schemi di espressione genica che assomigliano in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per esaminare se questo metodo può essere utilizzato per lo studio della patologia cutanea, abbiamo applicato la stessa pipeline sperimentale e di analisi per indagare i cheratinociti che portano mutazioni del fattore di trascrizione p63 che derivano da pazienti con ectrodattilia, displasia ectodermica e sindrome labbro/palatoschisi (CEE)^11,12. Questo protocollo si concentra sulla differenziazione in vitro dei cheratinociti e sulla successiva analisi bioinformatica dell’RNA-seq. Altri passaggi della procedura completa come l’estrazione dell’RNA, la preparazione del campione RNA-seq e la costruzione della biblioteca, sono ben documentati e possono essere facilmente seguiti, specialmente quando si utilizzano molti kit commerciali comunemente usati. Pertanto, questi passaggi sono descritti solo brevemente nel protocollo. I dati mostrano che questa pipeline è adatta per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

Protocol

Le biopsie cutanee sono state prelevate dal tronco di volontari sani o pazienti con mutazioni p63, per impostare la coltura primaria di cheratinociti. Tutte le procedure relative alla creazione di cheratinociti primari umani sono state approvate dal comitato etico del Radboud University Nijmegen Medical Centre (“Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen”). È stato ottenuto il consenso informato. 1. Differenziazione dei cheratinociti primari umani per inibizione del contatto P…

Representative Results

Differenziazione normale dei cheratinociti e analisi RNA-seqIn questo esperimento, le linee cheratinociti derivate da cinque individui sono state utilizzate per la differenziazione e le analisi RNA-seq. La figura 1 riassume la procedura sperimentale di differenziazione e i risultati dell’analisi RNA-seq. Una panoramica delle procedure di differenziazione in vitro dei cheratinociti normali e dei cambiamenti della morfologia cellulare durante la differenziazione è illustr…

Discussion

Questo lavoro descrive un metodo per indurre la differenziazione dei cheratinociti umani e la successiva caratterizzazione usando analisi RNA-seq. Nella letteratura attuale, molti studi sulla differenziazione dei cheratinociti umani usano altri due metodi, con un’alta concentrazione di calcio o con siero come metodi per indurre la^{differenziazione 2,3,23}. Una relazione precedente ha confrontato attentamente questi tre diversi<sup…

Materials

Bioanalyzer 2100	Agilent	G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE)	Lonza		Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system	Bio-Rad		qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Epidermal Growth Factor (EGF)	Lonza		Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98%	Sigma-Aldrich	E9508
High Sensitivity DNA chips	Agilent	5067-4626
Hydrocortison	Lonza		Part of the bulletKit
Insulin	Lonza		Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit	BioRad	170-8886
iScript cDNA synthesis	Bio rad	1708890
KAPA Library Quant Kit	Roche	07960255001	Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase	Roche	KK8540	RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit	Lonza	192060
Nanodrop	deNovix	DS-11 FX (model)	Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24	Illumnia	NOVA-514103	6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513