Presenteras här är en stegvis förfarande för in vitro-differentiering av mänskliga primära keratinocyter genom kontakt hämning följt av karakterisering på molekylär nivå genom RNA-seq analys.
Human primära keratinocyter används ofta som in vitro-modeller för studier på epidermal differentiering och relaterade sjukdomar. Metoder har rapporterats för in vitro-differentiering av keratinocyter odlade i tvådimensionella (2D) nedsänkta seder med hjälp av olika induktionsförhållanden. Beskrivs här är ett förfarande för 2D in vitro keratinocyte differentiering metod genom kontakt hämning och efterföljande molekylär karakterisering av RNA-seq. I korthet odlas keratinocyter i definierat keratinocyter medium kompletteras med tillväxtfaktorer tills de är helt konfluenta. Differentiering framkallas av nära kontakter mellan keratinocyterna och stimuleras ytterligare genom att tillväxtfaktorer i mediet utesluts. Med hjälp av RNA-seq analyser, det visas att både 1) differentierade keratinocyter uppvisar distinkta molekylära signaturer under differentiering och 2) den dynamiska genen uttrycksmönstret liknar till stor del celler under epidermal stratifiering. När det gäller jämförelse med normala keratinocyter differentiering, keratinocyter redovisade mutationer av transkriptionsfaktorn p63 uppvisar ändrade morfologi och molekylära signaturer, överensstämmer med deras differentiering defekter. Sammanfattningsvis, detta protokoll detaljer stegen för 2D in vitro keratinocyte differentiering och dess molekylära karakterisering, med betoning på bioinformatisk analys av RNA-seq data. Eftersom RNA-utvinning och RNA-seq-förfaranden har varit väldokumenterade, är det inte i fokus för detta protokoll. Det experimentella förfarandet av in vitro keratinocyte differentiering och bioinformatisk analys pipeline kan användas för att studera molekylära händelser under epidermal differentiering i friska och sjuka keratinocyter.
Mänskliga primära keratinocyter som härrör från den mänskliga huden används ofta som en cellulär modell för att studera biologi epidermis1,2,3,4. Stratifieringen av epidermis kan modelleras genom keratinocyte differentiering, antingen i en 2D nedsänkt monolayer mode eller 3D luft-lyft organotypic modell2,3,5,6,7. Även om 3D-modeller har blivit allt viktigare att bedöma den epidermala strukturen och funktionen, används 2D-differentieringsmodeller fortfarande i stor utsträckning, på grund av deras bekvämlighet och möjligheten att generera ett stort antal celler för analyser.
Olika villkor har tillämpats för inducerande keratinocyter differentiering i 2D, inklusive tillsats av serum, hög koncentration av kalcium, lägre temperatur och hämning av epidermal tillväxtfaktor receptorer2,3. Var och en av dessa metoder har validerats av ett antal keratinocyte differentieringsmarkörgener och visat sig vara effektiva vid bedömning av keratinocyte differentiering, även under patologiska förhållanden. Dessa induktionsförhållanden uppvisar emellertid också skillnader i deras differentieringseffektivitet och kinetik när specifika paneler av markörgenerundersöks 2,3.
En av dessa metoder innebär keratinocyte kontakt hämning och utarmning av tillväxtfaktorer i odlingsmediet8. Det har visat sig att keratinocyter kan differentiera spontant när celler når full densitet. Om tillväxtfaktorer i odlingsmediet exkluderas kan differentieringen ytterligare förstärkas. Metoden som kombinerar kontakthämning och utarmning av tillväxtfaktorer har visat sig generera differentierade keratinocyter med genuttrycksmönster som liknar den normala stratifierade epidermis när man använder flera epidermala markörer3, vilket tyder på att denna modell är lämplig för att studera normal keratinocyter differentiering. Nyligen har två omfattande genuttryck analyser av keratinocyte differentiering med hjälp av denna modell rapporterats9,10. Forskare validerade denna modell på molekylär nivå och visade att den kan användas för att studera normal och sjuka keratinocyter differentiering.
Detta protokoll beskriver förfarandet för in vitro-differentieringsmetoden och molekylär analys av differentierade celler med hjälp av RNA-seq. Det illustrerar också karakterisering av transkriptomet av celler på differentiering dag 0 (spridning skede), dag 2, dag 4, och dag 7 (tidigt, mitten, och sen differentiering, respektive). Det visas att differentierade keratinocyter visa genuttryck mönster som till stor del liknar celler under epidermal stratifiering. För att undersöka om denna metod kan användas för att studera hudpatologi, applicerade vi samma experimentella och analyspipeline för att undersöka keratinocyter som bär på mutationer av transkriptionsfaktorn p63 som härrör från patienter med ectrodactyly, ektodermala displasi och läpp-/gomspalt (EEG)syndrom 11,12. Detta protokoll fokuserar på in vitro-differentiering av keratinocyter samt efterföljande bioinformatisk analys av RNA-seq. Andra steg i det kompletta förfarandet såsom RNA extraktion, RNA-seq provberedning och bibliotek konstruktion, är väl dokumenterade och kan lätt följas, särskilt när du använder många vanligen används kommersiella kit. Därför beskrivs dessa steg bara kortfattat i protokollet. Uppgifterna visar att denna pipeline är lämplig för att studera molekylära händelser under epidermal differentiering i friska och sjuka keratinocyter.
Detta arbete beskriver en metod för att inducera human keratinocyte differentiering och efterföljande karakterisering med hjälp av RNA-seq analyser. I den aktuella litteraturen används i många studier om human keratinocyte differentiering två andra metoder, med en hög kalciumkoncentration eller med serum som metoder för att inducera differentiering2,3,23. En tidigare rapport noggrant jämfört dessa tre olika metoder<sup…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av Nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud University stipendium (H.Z.); och kinesiska stipendierådet bevilja 201406330059 (J.Q.).
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |