Karakterisering av In Vitro Differentiering av mänskliga primära keratinocyter genom RNA-Seq Analys
Summary
Presenteras här är en stegvis förfarande för in vitro-differentiering av mänskliga primära keratinocyter genom kontakt hämning följt av karakterisering på molekylär nivå genom RNA-seq analys.
Abstract
Human primära keratinocyter används ofta som in vitro-modeller för studier på epidermal differentiering och relaterade sjukdomar. Metoder har rapporterats för in vitro-differentiering av keratinocyter odlade i tvådimensionella (2D) nedsänkta seder med hjälp av olika induktionsförhållanden. Beskrivs här är ett förfarande för 2D in vitro keratinocyte differentiering metod genom kontakt hämning och efterföljande molekylär karakterisering av RNA-seq. I korthet odlas keratinocyter i definierat keratinocyter medium kompletteras med tillväxtfaktorer tills de är helt konfluenta. Differentiering framkallas av nära kontakter mellan keratinocyterna och stimuleras ytterligare genom att tillväxtfaktorer i mediet utesluts. Med hjälp av RNA-seq analyser, det visas att både 1) differentierade keratinocyter uppvisar distinkta molekylära signaturer under differentiering och 2) den dynamiska genen uttrycksmönstret liknar till stor del celler under epidermal stratifiering. När det gäller jämförelse med normala keratinocyter differentiering, keratinocyter redovisade mutationer av transkriptionsfaktorn p63 uppvisar ändrade morfologi och molekylära signaturer, överensstämmer med deras differentiering defekter. Sammanfattningsvis, detta protokoll detaljer stegen för 2D in vitro keratinocyte differentiering och dess molekylära karakterisering, med betoning på bioinformatisk analys av RNA-seq data. Eftersom RNA-utvinning och RNA-seq-förfaranden har varit väldokumenterade, är det inte i fokus för detta protokoll. Det experimentella förfarandet av in vitro keratinocyte differentiering och bioinformatisk analys pipeline kan användas för att studera molekylära händelser under epidermal differentiering i friska och sjuka keratinocyter.
Introduction
Mänskliga primära keratinocyter som härrör från den mänskliga huden används ofta som en cellulär modell för att studera biologi epidermis1,2,3,4. Stratifieringen av epidermis kan modelleras genom keratinocyte differentiering, antingen i en 2D nedsänkt monolayer mode eller 3D luft-lyft organotypic modell2,3,5,6,7. Även om 3D-modeller har blivit allt viktigare att bedöma den epidermala strukturen och funktionen, används 2D-differentieringsmodeller fortfarande i stor utsträckning, på grund av deras bekvämlighet och möjligheten att generera ett stort antal celler för analyser.
Olika villkor har tillämpats för inducerande keratinocyter differentiering i 2D, inklusive tillsats av serum, hög koncentration av kalcium, lägre temperatur och hämning av epidermal tillväxtfaktor receptorer2,3. Var och en av dessa metoder har validerats av ett antal keratinocyte differentieringsmarkörgener och visat sig vara effektiva vid bedömning av keratinocyte differentiering, även under patologiska förhållanden. Dessa induktionsförhållanden uppvisar emellertid också skillnader i deras differentieringseffektivitet och kinetik när specifika paneler av markörgenerundersöks 2,3.
En av dessa metoder innebär keratinocyte kontakt hämning och utarmning av tillväxtfaktorer i odlingsmediet8. Det har visat sig att keratinocyter kan differentiera spontant när celler når full densitet. Om tillväxtfaktorer i odlingsmediet exkluderas kan differentieringen ytterligare förstärkas. Metoden som kombinerar kontakthämning och utarmning av tillväxtfaktorer har visat sig generera differentierade keratinocyter med genuttrycksmönster som liknar den normala stratifierade epidermis när man använder flera epidermala markörer3, vilket tyder på att denna modell är lämplig för att studera normal keratinocyter differentiering. Nyligen har två omfattande genuttryck analyser av keratinocyte differentiering med hjälp av denna modell rapporterats9,10. Forskare validerade denna modell på molekylär nivå och visade att den kan användas för att studera normal och sjuka keratinocyter differentiering.
Detta protokoll beskriver förfarandet för in vitro-differentieringsmetoden och molekylär analys av differentierade celler med hjälp av RNA-seq. Det illustrerar också karakterisering av transkriptomet av celler på differentiering dag 0 (spridning skede), dag 2, dag 4, och dag 7 (tidigt, mitten, och sen differentiering, respektive). Det visas att differentierade keratinocyter visa genuttryck mönster som till stor del liknar celler under epidermal stratifiering. För att undersöka om denna metod kan användas för att studera hudpatologi, applicerade vi samma experimentella och analyspipeline för att undersöka keratinocyter som bär på mutationer av transkriptionsfaktorn p63 som härrör från patienter med ectrodactyly, ektodermala displasi och läpp-/gomspalt (EEG)syndrom 11,12. Detta protokoll fokuserar på in vitro-differentiering av keratinocyter samt efterföljande bioinformatisk analys av RNA-seq. Andra steg i det kompletta förfarandet såsom RNA extraktion, RNA-seq provberedning och bibliotek konstruktion, är väl dokumenterade och kan lätt följas, särskilt när du använder många vanligen används kommersiella kit. Därför beskrivs dessa steg bara kortfattat i protokollet. Uppgifterna visar att denna pipeline är lämplig för att studera molekylära händelser under epidermal differentiering i friska och sjuka keratinocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta arbete beskriver en metod för att inducera human keratinocyte differentiering och efterföljande karakterisering med hjälp av RNA-seq analyser. I den aktuella litteraturen används i många studier om human keratinocyte differentiering två andra metoder, med en hög kalciumkoncentration eller med serum som metoder för att inducera differentiering2,3,23. En tidigare rapport noggrant jämfört dessa tre olika metoder<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud University stipendium (H.Z.); och kinesiska stipendierådet bevilja 201406330059 (J.Q.).
Materials
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
| iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
| KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
| KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
| NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
Riferimenti
- Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
- Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
- Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
- Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
- Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
- Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
- Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
- Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
- Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
- . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
- Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
- . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
- . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3′ RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
- Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
- . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
- . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)
