एडल्ट कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट और माओफीब्रोब्लास्ट का अलगाव और लक्षण वर्णन
Summary
फाइब्रोब्लास्ट की शुद्ध आबादी प्राप्त करना घाव की मरम्मत और फाइब्रोसिस में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित एक विस्तृत विधि है जो फाइब्रोब्लास्ट और मायोफिब्रोब्लास्ट को अघायल और घायल माउस दिलों से अलग करने के लिए है, जिसके बाद प्रतिकार, आरटीपीसीआर, फ्लोरेसेंस-असिस्टेड सेल छंटाई द्वारा उनकी शुद्धता और कार्यक्षमता का लक्षण वर्णन किया जाता है, और कोलेजन जेल संकुचन।
Abstract
चोट के जवाब में कार्डियक फाइब्रोसिस घाव भरने के लिए एक शारीरिक प्रतिक्रिया है। फाइब्रोसिस को कम करने वाले फाइब्रोब्लास्ट उपप्रकारों का अध्ययन करने और उन्हें लक्षित करने के प्रयास किए गए हैं । हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट अनुसंधान शांत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट की पहचान करने के लिए सार्वभौमिक स्वीकार्य फाइब्रोब्लास्ट मार्कर की कमी के कारण रुकावट आई है । फाइब्रोब्लास्ट एक विषम कोशिका आबादी है, जिससे उन्हें अलग-थलग और विशेषता देना मुश्किल हो जाता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में अघायल और घायल माउस दिलों से फाइब्रोब्लास्ट और मायोफीब्रोब्लास्ट को समृद्ध करने के लिए तीन अलग-अलग तरीकों का वर्णन किया गया है। फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए एक मानक और विश्वसनीय प्रोटोकॉल का उपयोग करने से होमोस्टोसिस के साथ-साथ फाइब्रोसिस मॉड्यूलेशन में उनकी भूमिकाओं का अध्ययन संभव हो जाएगा।
Introduction
कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट, मेसेनचिमल मूल की कोशिकाएं, होमोस्टोसिस1के दौरान हृदय वास्तुकला के रखरखाव के अलावा दिल में विद्युत चालन और यांत्रिक बलों को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। चोट के बाद, इन कोशिकाओं को सक्रिय, विस्तार, और बाह्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन2का उत्पादन कर रहे हैं । कई प्रीक्लिनिकल अध्ययनों से फाइब्रोब्लास्ट को महत्वपूर्ण सेलुलर नियामकों के रूप में उजागर किया गया है जो घायल हृदय3 की संरचनात्मक अखंडता के साथ-साथ ईसीएम प्रोटीन के अनियंत्रित उत्पादन और जमाव के लिए जिम्मेदार मुख्य प्रभावक कोशिकाओं को बनाए रखते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कठोर निशान गठन और हृदय विफलता4होती है। फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं का एक विषम समूह है, जिससे प्रो-फाइब्रोटिक मैल्अनुकूलित गुणों से उनके पुनर्विचार कार्य को विच्छेदन करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है। हाल ही में, मायोकार्डियल चोट के बाद दो अलग-अलग फाइब्रोब्लास्ट उपप्रकारों की कार्यात्मक विषमता को परिभाषित किया गया है, जो विभिन्न फाइब्रोब्लास्ट उपप्रकारों को अलग करने और घाव भरने में उनकी भूमिका का अध्ययन करनेकीसंभावना का संकेत देता है 5।
एक शुद्ध फाइब्रोब्लास्ट आबादी प्राप्त करना मरम्मत और फाइब्रोसिस में उनकी कार्यात्मक भूमिका को कम करने में महत्वपूर्ण है। हालांकि, कई फाइब्रोब्लास्ट मार्कर की उपस्थिति जो अन्य सेल प्रकारों को पहचानती है, इसे काफी हद तक शुद्ध फाइब्रोब्लास्ट आबादी6को अलग करना चुनौतीपूर्ण बनाती है। कई सुरुचिपूर्ण अध्ययनों ने अघायल और घायल मायोकार्डियम से कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए चतुर तरीके तैयार किए हैं। फाइब्रोब्लास्ट को समृद्ध करने की सबसे लोकप्रिय और सुस्थापित विधि एंजाइमैटिक ऊतक पाचन7के बाद चयनात्मक आसंजन के माध्यम से है।
इसके अतिरिक्त, सेल सतह एंटीजन पर आधारित फाइब्रोब्लास्ट की फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (एफएसीएस) को सफलतापूर्वक8वर्णित किया गया है। अध्ययन में, एंजाइमैटिक पाचन के बाद, मेसेंचिमल कोशिकाओं को मानस-नकारात्मक (लिन: Ter119−CD45− CD31−) और gp38-positive (gp38+)माउस दिलों से हल किया गया था।−− GP38+ ve कोशिकाओं को col1α1 और अन्य मेसेनचिमल मार्कर की उनकी सह-अभिव्यक्ति के आधार पर फाइब्रोब्लास्ट होने की पुष्टि हुई थी। हालांकि पेट्री डिश में वेंट्रिकल को विच्छेदन करने के बाद अधिकांश ऊतक पाचन पूरा हो गया है, हाल ही में हुए एक अध्ययन में मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स को अलग करने के लिए बाएं वेंट्रिकल के प्रत्यक्ष सुई एंजाइम पेरिकफ्यूजन के उपयोग की जांच की गई है जिसमें फाइब्रोब्लास्ट9शामिल हैं। फिर इस मामले में चुनिंदा आसंजन से फाइब्रोब्लास्ट अलग-थलग पड़ गए।
यह प्रोटोकॉल तीन तरीकों का उपयोग करके फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव और संवर्धन का वर्णन करता है। पहला एक पहले से ही स्थापित विधि है जिसमें एंजाइमैटिक पाचन के बाद फाइब्रोब्लास्ट के चयनात्मक आसंजन को शामिल किया गया है। दूसरी विधि का उपयोग मुख्य रूप से चोट-प्रेरित अल्फा चिकनी मांसपेशी को अलग करने के लिए किया जाता है जो मायोफेब्रोब्लास्ट को व्यक्त करता है। तीसरी विधि में एक एंजाइम-डाइजेस्ट कार्डियक सेल निलंबन हेमेटोपोइटिक और एंडोथेलियल कोशिकाओं की अनुक्रमिक, चुंबकीय कमी शामिल है। कमी के बाद, चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके एंटीजन एमईएफएसके4 की उपस्थिति के आधार पर फाइब्रोब्लास्ट/मायोफीब्रोब्लास्ट अलग-थलग कर दिए जाते हैं। हाल ही में, MEFSK4 को शांत करने के साथ-साथ सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट पर मौजूद एंटीजन के रूप में वर्णित किया गया है, जिससे यह फाइब्रोब्लास्ट पहचान और अलगाव के लिए एक उपयुक्त मार्कर बन गया है। स्वाभाविक रूप से, यहां वर्णित सभी तरीकों की अनूठी सीमाएं हैं। इसलिए प्रवाह विश्लेषण, इम्यूनोस्टेनिंग और अर्ध-मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा अलग-थलग पड़े सेल आबादी की शुद्धता की जांच करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। हालांकि, इन पद्धतियों पर विस्तार किया जा सकता है, और महत्वपूर्ण प्रयोगों के लिए फाइब्रोब्लास्ट और myofibroblast आबादी का उपयोग करने से पहले अन्य दूषित आबादी को बाहर करने के लिए अतिरिक्त मार्कर जोड़े जा सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं का एक विषम समूह है, जिसकी पहचान मार्कर के विविध सेट द्वारा की जाती है। फाइब्रोब्लास्ट की पहचान करने के लिए जिन प्रोटीन मार्कर का इस्तेमाल किया गया है, वे डिस्कोइडिन डोमेन रिसे?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक αSMA-GFP चूहों के लिए डॉ इवो कलाजिक का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के राष्ट्रीय आयुर्विज्ञान संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या R01GM118300 (एसएस), राष्ट्रीय जैव चिकित्सा इमेजिंग और एनआईएच के बायोइंजीनियरिंग संस्थान के तहत समर्थन दिया गया था । पुरस्कार संख्या R21EB019509 (P.P.Y.) के तहत, और पुरस्कार संख्या 17SDG33630187 (एसएस) के तहत अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के वैज्ञानिक विकास अनुदान । फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण VUMC फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन में किए गए थे जो वेंडरबिल्ट इंगराम कैंसर सेंटर (P30 CA68485) और वेंडरबिल्ट पाचन रोग अनुसंधान केंद्र (DK058404) द्वारा समर्थित है।
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
Riferimenti
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