عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية
Summary
الحصول على السكان نقية من الخلايا الليفية أمر بالغ الأهمية لدراسة دورها في إصلاح الجروح والتليف. وصف هنا هو طريقة مفصلة لعزل الخلايا الليفية وmyofibroblasts من قلوب الفئران غير المصابة والجرحى تليها توصيف نقاوتها ووظائفها من قبل الفلورسة المناعية ، RTPCR ، الفلورسة بمساعدة فرز الخلايا ، و الكولاجين هلام الانكماش.
Abstract
التليف القلبي استجابة للإصابة هو استجابة فسيولوجية لتضميد الجروح. وقد بُذلت جهود لدراسة واستهداف الأنواع الفرعية للانفجار الليفي التي تخفف من التليف. ومع ذلك ، تم إعاقة أبحاث الخلايا الليفية بسبب عدم وجود علامات ليفية مقبولة عالميًا لتحديد الخلايا الليفية الممتعة وكذلك الخلايا الليفية المنشطة. الخلايا الليفية هي مجموعة خلايا غير متجانسة ، مما يجعلها صعبة العزل وتوصيفها. يصف البروتوكول المقدم ثلاث طرق مختلفة لإثراء الخلايا الليفية والخلايا الليفية من قلوب الفئران غير المصابة والمصابة. استخدام بروتوكول قياسي وموثوق به لعزل الخلايا الليفية سيمكن من دراسة أدوارها في التوازن وكذلك تعديل التليف.
Introduction
الخلايا الليفية القلبية، الخلايا ذات الأصل المتوسط، تلعب دورا هاما في الحفاظ على التوصيل الكهربائي والقوى الميكانيكية في القلب بالإضافة إلى الحفاظ على الهندسة المعمارية القلبية أثناء التوازن1. بعد الإصابة ، يتم تنشيط هذه الخلايا ، وتوسيعها ، وإنتاج بروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM)2. وقد كشفت العديد من الدراسات قبل السريرية الخلايا الليفية والمنظمين الخلوية الحرجة التي تحافظ على السلامة الهيكلية للقلب المصاب3 وكذلك الخلايا المؤثرات الرئيسية المسؤولة عن إنتاج وترسب البروتينات ECM دون رادع، مما أدى إلى تشكيل ندبة قاسية وفشل القلب4. الخلايا الليفية هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا ، مما يجعل من الصعب تشريح وظيفتها العلاجية من الخصائص غير التكيفية المؤيدة للليفية. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد التغاير الوظيفي لهذين النوعين الفرعيين الليفيين المتميزين بعد إصابة عضلة القلب ، مما يشير إلى إمكانية عزل الأنواع الفرعية المختلفة للخلايا الليفية ودراسة دورها في التئام الجروح5.
الحصول على الخلايا الليفية النقية أمر بالغ الأهمية في تحديد دورهم الوظيفي في الإصلاح والتليف. ومع ذلك ، فإن وجود علامات الليفية المتعددة التي تعترف بأنواع الخلايا الأخرى تجعل من الصعب عزل مجموعة من الخلايا الليفية النقية إلى حد كبير6. وقد وضعت العديد من الدراسات الأنيقة طرق ذكية لعزل الخلايا الليفية القلبية من غير المصابين والجرحى عضلة القلب. الطريقة الأكثر شعبية وراسخة لإثراء الخلايا الليفية هي من خلال الالتصاق الانتقائي بعد هضم الأنسجة الأنزيمية7.
بالإضافة إلى ذلك ، تم بنجاح وصف فرز الخلايا المنشط ة (FACS) من الخلايا الليفية استنادًا إلى مستضدات سطح الخلية8. في الدراسة، بعد الهضم الأنزيمي، تم فرز الخلايا المتوسطة كنسب سلبي (لين: Ter119−CD45−CD31−) وgp38-إيجابية (gp38+) من قلوب الفئران. تم تأكيد Gp38+ ve الخلايا لتكون الخلايا الليفية على أساس التعبير المشترك من col1α1 وغيرها من علامات mesenchymal. على الرغم من أن معظم هضم الأنسجة يتم الانتهاء بعد تشريح البطين في طبق بيتري، وقد حققت دراسة حديثة استخدام إنزيم إبرة مباشرة من البطين الأيسر لعزل myocytes وغير myocytes التي تشمل الخلايا الليفية9. ثم تم عزل الخلايا الليفية عن طريق الالتصاق الانتقائي في هذه الحالة.
يصف هذا البروتوكول عزل وإثراء الخلايا الليفية باستخدام ثلاث طرق. الأول هو طريقة راسخة بالفعل تنطوي على الالتصاق الانتقائي للخلايا الليفية بعد الهضم الأنزيمي. يتم استخدام الطريقة الثانية لعزل في المقام الأول إصابة الناجمة عن العضلات ألفا الملساء التعبير عن myofibroblasts. الطريقة الثالثة تنطوي على الاستنفاد المغناطيسي التتابعي لتعليق خلايا القلب المهضم ة من الخلايا الدمية والفيوثيريلية. بعد الاستنفاد ، يتم عزل الخلايا الليفية / myofibroblasts استنادًا إلى وجود مستضد MEFSK4 باستخدام الخرز المغناطيسي. في الآونة الأخيرة ، وقد وصفت MEFSK4 كما antigen الحاضر على quiescent وكذلك تنشيط الخلايا الليفية ، مما يجعلها علامة مناسبة لتحديد الخلايا الليفية والعزلة. وبطبيعة الحال، فإن جميع الأساليب الموضحة هنا لها قيود فريدة من نوعها. ولذلك يوصى بشدة بالتحقق من نقاء مجموعة الخلايا المعزولة عن طريق تحليل التدفق ، وتلطيخ المناعة ، وشبه الكمية PCR في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، يمكن توسيع نطاق هذه المنهجيات ، ويمكن إضافة علامات إضافية من أجل استبعاد المجموعات السكانية الملوثة الأخرى قبل استخدام الخلايا الليفية والخلايا الليفية للسكان لإجراء تجارب حاسمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا الليفية هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا، تم تحديدها من قبل مجموعة متنوعة من العلامات. علامات البروتين التي تم استخدامها لتحديد الخلايا الليفية هي مستقبلات المجال discoidin 2 (DDR2)، فيفينكتين، vimentin، الكولاجين الأول والثالث، وThy115،,16،,17،</su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يريد المؤلفون أن يشكروا الدكتور إيفو كالازيكيتش على فئران αSMA-GFP. تم دعم البحوث المبلغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة R01GM118300 (S.S.) ، المعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية في المعاهد القومية للصحة تحت رقم الجائزة R21EB019509 (P.P.Y.)، ومنحة تنمية العلماء من جمعية القلب الأمريكية تحت رقم الجائزة 17SDG33630187 (S.S.). تم إجراء تحليلات قياس التدفق الخلوي في الموارد المشتركة VUMC Flow Cytometry Shared resource التي يدعمها مركز فاندربيلت إنغرام للسرطان (P30 CA68485) ومركز أبحاث أمراض الجهاز الهضمي فاندربيلت (DK058404).
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
Riferimenti
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
- Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
- Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
- Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
- Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
- Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
- Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
- Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
- Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).
