Isolation og karakterisering af voksne hjertefibroblaster og Myofibroblaster
Summary
Opnåelse af en ren population af fibroblaster er afgørende for at studere deres rolle i sårreparation og fibrose. Beskrevet her er en detaljeret metode til at isolere fibroblaster og myofibroblaster fra uskadte og tilskadekomne musehjerter efterfulgt af karakterisering af deres renhed og funktionalitet ved immunfluorescens, RTPCR, fluorescens-assisteret cellesortering, og kollagen gel sammentrækning.
Abstract
Hjertefibrose som reaktion på skade er en fysiologisk reaktion på sårheling. Der er gjort en indsats for at studere og målrette fibroblast undertyper, der mindsker fibrose. Men, fibroblast forskning er blevet hindret på grund af manglen på universelt acceptable fibroblast markører til at identificere quiescent samt aktiveret fibroblaster. Fibroblaster er en heterogen cellepopulation, hvilket gør dem vanskelige at isolere og karakterisere. Den præsenterede protokol beskriver tre forskellige metoder til at berige fibroblaster og myofibroblaster fra uskadte og tilskadekomne musehjerter. Ved hjælp af en standard og pålidelig protokol til at isolere fibroblaster vil gøre det muligt at studere deres roller i homøostase samt fibrose graduering.
Introduction
Hjertefibroblaster, celler af mesenkymale oprindelse, spiller en væsentlig rolle i opretholdelsen af den elektriske ledning og mekaniske kræfter i hjertet ud over vedligeholdelse af hjertearkitektur under homøostase1. Efter skade aktiveres disse celler, udvides og producerer ekstracellulære matrixproteiner (ECM)2. Mange prækliniske undersøgelser har afsløret fibroblaster som kritiske cellulære regulatorer, der opretholder den strukturelle integritet af et skadet hjerte3 samt vigtigste effektorceller, der er ansvarlige for ukontrolleret produktion og aflejring af ECM-proteiner, hvilket resulterer i stiv ardannelse og hjertesvigt4. Fibroblaster er en heterogen gruppe af celler, hvilket gør det udfordrende at dissekere deres reparative funktion fra pro-fibrotiske maladaptive egenskaber. For nylig er den funktionelle heterogenitet af to forskellige fibroblast undertyper efter myokardieskade blevet defineret, hvilket indikerer muligheden for at isolere forskellige fibroblast undertyper og studere deres rolle i sårheling5.
Opnåelse af en ren fibroblast befolkning er afgørende i delineating deres funktionelle rolle i reparation og fibrose. Men tilstedeværelsen af flere fibroblast markører, der genkender andre celletyper gør det udfordrende at isolere en væsentligt ren fibroblast population6. Flere elegante undersøgelser har udtænkt smarte måder at isolere hjertefibroblaster fra uskadte og sårede myocardium. Den mest populære og veletablerede metode til berigelse af fibroblaster er gennem selektiv vedhæftning efter enzymatisk vævsfordøjelse7.
Derudover er fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) af fibroblaster baseret på celleoverfladeantigener blevet beskrevet med succes8. I undersøgelsen blev mesenkymale celler efter enzymatisk fordøjelse sorteret som afstamningsnegative (Lin: Ter119−CD45−CD31−) og gp38-positive (gp38+) fra musehjerter. Gp38+ve celler blev bekræftet at være fibroblaster baseret på deres co-udtryk af col1α1 og andre mesenkymale markører. Selv om de fleste væv fordøjelse er afsluttet efter dissekere ud ventrikel i en petriskål, en nylig undersøgelse har undersøgt brugen af en direkte nål enzym perfusion af venstre hjertekammer til at isolere myocytter og ikke-myocytter, som omfatter fibroblaster9. Fibroblaster blev derefter isoleret ved selektiv vedhæfte lse i dette tilfælde.
Denne protokol beskriver isolering og berigelse af fibroblaster ved hjælp af tre metoder. Den første er en allerede etableret metode, der involverer selektiv vedhæftning af fibroblaster efter enzymatisk fordøjelse. Den anden metode bruges til primært at isolere skade-induceret alpha glat muskel udtrykke myofibroblaster. Den tredje metode omfatter sekventiel, magnetisk udtynding af en enzymfordøjet hjertecellesuspension af hæmatopoietiske og endotelceller. Efter udtømning isoleres fibroblaster/myofibroblaster baseret på tilstedeværelsen af antigenet MEFSK4 ved hjælp af magnetiske perler. For nylig, MEFSK4 er blevet beskrevet som et antigen til stede på quiescent samt aktiveret fibroblaster, hvilket gør det til en passende markør for fibroblast identifikation og isolation. Naturligvis har alle de metoder, der er beskrevet her, unikke begrænsninger. Det anbefales derfor stærkt at kontrollere renheden af den isolerede cellepopulation ved flowanalyse, immunfarvning og semi-kvantitativ pcr i realtid. Men, disse metoder kan udvides på, og yderligere markører kan tilføjes for at udelukke andre forurenende populationer før udnytte fibroblast og myofibroblast populationer for afgørende eksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fibroblaster er en heterogen gruppe af celler, identificeret ved forskellige sæt markører. De proteinmarkører, der er blevet brugt til at identificere fibroblaster, er diskoidreceptoren 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, kollagen I og III og Thy115,16,17,18,19,20. Mens vimentin er blevet brugt til at identificere uskadte qui…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. Ivo Kalajzic for αSMA-GFP mus. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health (NIH) under Award Number R01GM118300 (SS), National Institute of Biomedical Imaging og Bioengineering af NIH under Award Number R21EB019509 (P.P.Y.) og Scientist Development Grant of the American Heart Association under Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow cytometri analyser blev udført på VUMC Flow Cytometri Shared Resource, som understøttes af Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) og Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
Riferimenti
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
- Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
- Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
- Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
- Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
- Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
- Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
- Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
- Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).
