Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten
Summary
Het verkrijgen van een zuivere populatie van fibroblasten is cruciaal voor het bestuderen van hun rol in wondherstel en fibrose. Hier beschreven is een gedetailleerde methode om fibroblasten en myofibroblasten te isoleren van niet gewonde en gewonde muisharten, gevolgd door karakterisering van hun zuiverheid en functionaliteit door immunofluorescentie, RTPCR, fluorescentie-ondersteunde cel sorteren, en collageen gel contractie.
Abstract
Hartfibrose in reactie op letsel is een fysiologische reactie op wondgenezing. Er zijn inspanningen geleverd om fibroblastsubtypes te bestuderen en te targeten die fibrose beperken. Echter, fibroblast onderzoek is belemmerd als gevolg van het ontbreken van universeel aanvaardbare fibroblast markers om rustige en geactiveerde fibroblasten te identificeren. Fibroblasten zijn een heterogene celpopulatie, waardoor ze moeilijk te isoleren en te karakteriseren. Het gepresenteerde protocol beschrijft drie verschillende methoden om fibroblasten en myofibroblasten te verrijken van niet-gewonde en gewonde muisharten. Met behulp van een standaard en betrouwbaar protocol om fibroblasten te isoleren zal de studie van hun rol in homeostase en fibrose modulatie mogelijk te maken.
Introduction
Cardiale fibroblasten, cellen van mesenchymale oorsprong, spelen een belangrijke rol bij het behoud van de elektrische geleiding en mechanische krachten in het hart in aanvulling op het onderhoud van cardiale architectuur tijdens homeostase1. Na letsel worden deze cellen geactiveerd, uittevouwen en produceren extracellulaire matrix (ECM) eiwitten2. Veel preklinische studies hebben aangetoond fibroblasten als kritische cellulaire regulatoren die de structurele integriteit van een gewond hart3 te handhaven, evenals de belangrijkste effector cellen die verantwoordelijk zijn voor ongecontroleerde productie en afzetting van ECM eiwitten, wat resulteert in stijve littekenvorming en hartfalen4. Fibroblasten zijn een heterogene groep cellen, waardoor het een uitdaging is om hun herstellende functie te ontleden van pro-fibrotische onaangepaste eigenschappen. Onlangs is de functionele heterogeniteit van twee verschillende fibroblast subtypes na myocardiale letsel gedefinieerd, wat wijst op de mogelijkheid van het isoleren van verschillende fibroblast subtypes en het bestuderen van hun rol in wondgenezing5.
Het verkrijgen van een pure fibroblast bevolking is cruciaal in het aflijnen van hun functionele rol in reparatie en fibrose. Echter, de aanwezigheid van meerdere fibroblast markers die andere celtypes herkennen maken het een uitdaging om een wezenlijk zuivere fibroblast bevolking te isoleren6. Verschillende elegante studies hebben slimme manieren bedacht om cardiale fibroblasten te isoleren van niet-gewonde en gewonde myocard. De meest populaire en gevestigde methode voor het verrijken van fibroblasten is door selectieve hechting na enzymatische weefselvertering7.
Bovendien is met de fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) van fibroblasten op basis van celoppervlakteantigenen met succes beschreven8. In de studie, na enzymatische spijsvertering, werden de mesenchymale cellen gesorteerd als lineage-negatief (Lin: Ter119−CD45−CD31−) en gp38-positief (gp38+) van muisharten. Gp38+ve cellen werden bevestigd te zijn fibroblasten op basis van hun co-expressie van col1α1 en andere mesenchymale markers. Hoewel de meeste weefselvertering is voltooid na het ontleden van de ventrikel in een petrischaaltje, heeft een recente studie het gebruik van een direct naaldenzym perfusie van de linker ventrikel onderzocht om myocyten en niet-myocyten te isoleren, waaronder fibroblasten9. Fibroblasten werden vervolgens geïsoleerd door selectieve hechting in dit geval.
Dit protocol beschrijft de isolatie en verrijking van fibroblasten met behulp van drie methoden. De eerste is een reeds vastgestelde methode waarbij selectieve hechting van fibroblasten na enzymatische spijsvertering. De tweede methode wordt gebruikt om voornamelijk te isoleren letsel-geïnduceerde alpha gladde spier uitdrukken myofibroblasten. De derde methode omvat sequentiële, magnetische uitputting van een enzym-verteerd hartcel suspensie van hematopoietische en endotheelcellen. Na uitputting worden fibroblasten/myofibroblasten geïsoleerd op basis van de aanwezigheid van het antigeen MEFSK4 met behulp van magnetische kralen. Onlangs is MEFSK4 beschreven als een antigeen aanwezig op zowel rustige als geactiveerde fibroblasten, waardoor het een geschikte marker is voor fibroblastidentificatie en isolatie. Natuurlijk, alle methoden hier beschreven hebben unieke beperkingen. Het wordt daarom ten zeerste aanbevolen om de zuiverheid van de geïsoleerde celpopulatie te controleren door stroomanalyse, immunostaining en semi-kwantitatieve real-time PCR. Echter, deze methoden kunnen worden uitgebreid op, en extra markers kunnen worden toegevoegd om andere vervuilende populaties uit te sluiten voorafgaand aan het gebruik van de fibroblast en myofibroblast populaties voor cruciale experimenten uit te sluiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fibroblasten zijn een heterogene groep cellen, geïdentificeerd door diverse set markers. De eiwitmarkers die zijn gebruikt om fibroblasten te identificeren zijn discoidin domeinreceptor 2 (DDR2), fibronectine, vimentin, collageen I en III, en Thy115,16,17,18,19,20. Overwegende dat vimentin is gebruikt om niet-gewonde rustige…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Dr. Ivo Kalajzic bedanken voor de αSMA-GFP muizen. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (NIH) onder Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering van de NIH onder Award Number R21EB019509 (P.P.Y.), en Scientist Development Grant van de American Heart Association onder Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow cytometrie analyses werden uitgevoerd in het VUMC Flow Cytometry Shared Resource die wordt ondersteund door het Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) en het Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
Riferimenti
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
- Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
- Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
- Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
- Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
- Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
- Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
- Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
- Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).
