Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten
Summary
Die Gewinnung einer reinen Population von Fibroblasten ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Rolle bei der Wundreparatur und Fibrose. Beschrieben ist eine detaillierte Methode, um Fibroblasten und Myofibroblasten von unverletzten und verletzten Mausherzen zu isolieren, gefolgt von der Charakterisierung ihrer Reinheit und Funktionalität durch Immunfluoreszenz, RTPCR, Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung und Kollagen-Gel-Kontraktion.
Abstract
Herzfibrose als Reaktion auf Verletzungen ist eine physiologische Reaktion auf die Wundheilung. Es wurden Anstrengungen unternommen, um Fibroblasten-Subtypen zu untersuchen und zu zielen, die Fibrose mildern. Die Fibroblastenforschung wurde jedoch aufgrund des Fehlens universell akzeptabler Fibroblasten-Marker behindert, um ruhehafte sowie aktivierte Fibroblasten zu identifizieren. Fibroblasten sind eine heterogene Zellpopulation, was sie schwer zu isolieren und zu charakterisieren macht. Das vorgestellte Protokoll beschreibt drei verschiedene Methoden zur Anreicherung von Fibroblasten und Myofibroblasten aus unverletzten und verletzten Mausherzen. Die Verwendung eines Standard- und zuverlässigen Protokolls zur Isolierung von Fibroblasten wird die Untersuchung ihrer Rolle bei der Homöostase sowie der Fibrosemodulation ermöglichen.
Introduction
Herzfibroblasten, Zellen mesenchymaler Herkunft, spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der elektrischen Leitung und mechanischen Kräfte im Herzen zusätzlich zur Aufrechterhaltung der Herzarchitektur während der Homöostase1. Nach der Verletzung werden diese Zellen aktiviert, erweitern und produzieren extrazelluläre Matrixproteine (ECM)2. Viele präklinische Studien haben Fibroblasten als kritische zelluläre Regulatoren aufgedeckt, die die strukturelle Integrität eines verletzten Herzens3 sowie Haupteffektorzellen, die für die unkontrollierte Produktion und Ablagerung von ECM-Proteinen verantwortlich sind, aufrecht erhalten, was zu einer steifen Narbenbildung und Herzinsuffizienzführt 4. Fibroblasten sind eine heterogene Gruppe von Zellen, was es schwierig macht, ihre reparative Funktion von pro-fibrotischen maladaptiven Eigenschaften zu sezieren. Kürzlich wurde die funktionelle Heterogenität von zwei unterschiedlichen Fibroblasten-Subtypen nach Einer Myokardverletzung definiert, was auf die Möglichkeit hindeutet, verschiedene Fibroblasten-Subtypen zu isolieren und ihre Rolle bei der Wundheilung zu untersuchen5.
Die Gewinnung einer reinen Fibroblastenpopulation ist entscheidend für die Abgrenzung ihrer funktionellen Rolle bei Derinstandunden- und Fibrose. Das Vorhandensein mehrerer Fibroblastenmarker, die andere Zelltypen erkennen, macht es jedoch schwierig, eine im Wesentlichen reine Fibroblastenpopulation zu isolieren6. Mehrere elegante Studien haben clevere Wege entwickelt, um Herzfibroblasten von unverletztem und verletztem Myokard zu isolieren. Die beliebteste und etablierteste Methode zur Anreicherung von Fibroblasten ist durch selektive Adhäsion nach enzymatischer Gewebeverdauung7.
Zusätzlich wurde die fluoreszenaktivierte Zellsortierung (FACS) von Fibroblasten auf Basis von Zelloberflächenantigenen erfolgreich beschrieben8. In der Studie wurden die mesenchymalen Zellen nach enzymatischer Verdauung als Lineage-negativ (Lin: Ter119–CD45–CD31)und gp38-positiv (gp38+) aus Mausherzen sortiert. Gp38+ve-Zellen wurden aufgrund ihrer Koexpression von col1-1 und anderen mesenchymalen Markern als Fibroblasten bestätigt. Obwohl die meisten Gewebeverdauungen nach dem Austeilen des Ventrikels in einer Petrischale abgeschlossen sind, hat eine aktuelle Studie die Verwendung einer direkten Nadelenzymperfusion des linken Ventrikels untersucht, um Myozyten und Nicht-Myozyten zu isolieren, die Fibroblasten enthalten9. Fibroblasten wurden dann in diesem Fall durch selektive Haftung isoliert.
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Anreicherung von Fibroblasten mit drei Methoden. Die erste ist eine bereits etablierte Methode mit selektiver Adhäsion von Fibroblasten nach enzymatischer Verdauung. Die zweite Methode wird verwendet, um in erster Linie verletzungsinduzierte Alpha glatte Muskel exsemitenDe Myofibroblasten zu isolieren. Die dritte Methode beinhaltet die sequenzielle, magnetische Erschöpfung einer enzymverdauten Herzzellsuspension von hämatopoetischen und endotheliaalen Zellen. Nach erschöpfender Erschöpfung werden Fibroblasten/Myofibroblasten basierend auf dem Vorhandensein des Antigens MEFSK4 unter Verwendung magnetischer Perlen isoliert. Kürzlich wurde MEFSK4 als Antigen beschrieben, das sowohl bei ruhelösenden als auch bei aktivierten Fibroblasten vorliegt, was es zu einem geeigneten Marker für die Fibroblasten-Identifikation und -Isolierung macht. Natürlich haben alle hier beschriebenen Methoden einzigartige Einschränkungen. Es wird daher dringend empfohlen, die Reinheit der isolierten Zellpopulation durch Strömungsanalyse, Immunfärbung und semiquantitative Echtzeit-PCR zu überprüfen. Diese Methoden können jedoch erweitert werden, und zusätzliche Marker können hinzugefügt werden, um andere kontaminierende Populationen auszuschließen, bevor die Fibroblasten- und Myofibroblastenpopulationen für wichtige Experimente verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fibroblasten sind eine heterogene Gruppe von Zellen, die durch verschiedene Marker identifiziert werden. Die Proteinmarker, die verwendet wurden, um Fibroblasten zu identifizieren, sind Discoidin-Domänenrezeptor 2 (DDR2), Fibronectin, Vimentin, Kollagen I und III und Thy115,,16,17,18,19,20. Während Vimentin verwendet wurde,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Dr. Ivo Kalajzic für die SMA-GFP-Mäuse danken. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (NIH) unter der Award-Nummer R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering des NIH unterstützt. unter Award Number R21EB019509 (P.P.Y.) und Scientist Development Grant der American Heart Association unter Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow-Zytometrie-Analysen wurden am VUMC Flow Cytometry Shared Resource durchgeführt, das vom Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) und dem Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404) unterstützt wird.
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
Riferimenti
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