בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים
Summary
קבלת אוכלוסייה טהורה של פיברותקיעות חיונית כדי ללמוד את תפקידם בתיקון פצעים פיברוזיס. המתואר כאן היא שיטה מפורטת כדי לבודד את הפיברוכדורים ומיוריסותליות מלבבות העכבר שנפגעו ונפצעו ולאחר מכן אפיון הטוהר והפונקציונליות שלהם על ידי immunofluorescence RTPCR, מיון תאים בסיוע פלואורסצנטית, ו התכווצות ג’ל לקולגן.
Abstract
פיברוזיס של הלב בתגובה לפציעה היא תגובה פיזיולוגית לריפוי הפצע. המאמצים נעשו כדי ללמוד ולמקד את סוגי בפיברוהפיצוץ המרכך פיברוזיס. עם זאת, מחקר פיברולפיצוץ כבר הפריע בשל חוסר של סמנים מקובלים בגידולים המקובלים לזהות שקט כמו גם הפעלת פיברופיצוצים. פיברותקיעות הם אוכלוסיית תאים הטרוגניים, מה שמקשה עליהם לבודד ולאפיין. הפרוטוקול המוצג מתאר שלוש שיטות שונות להעשיר את הגידולים השונים והמייופיברוונים מלבבות העכבר הפצועים. באמצעות פרוטוקול רגיל ואמין כדי לבודד הפיברוכדורים יאפשר לימוד תפקידם הומאוסטזיס כמו גם פיברוזיס אפנון.
Introduction
פיברותקיעות לב, תאים של מוצא mesenchymal, לשחק תפקיד משמעותי בשמירה על הולכה חשמלית וכוחות מכניים בלב בנוסף תחזוקה של אדריכלות לב במהלך הומאוסטזיס1. בעקבות פציעה, תאים אלה מופעלים, להרחיב, ולייצר מטריצה החילוץ (ECM) חלבונים2. מחקרים רבים קדם קליניים חשפו פיברומופיצוצים כמו הרגולטורים הסלולר קריטי השומרים על השלמות המבנית של הלב הפצוע3 , כמו גם התאים העיקריים אפקטור אחראי על ייצור לא מסומנת והפקדת חלבונים ecm, וכתוצאה מכך היווצרות צלקת נוקשה אי ספיקת לב4. פיברותקיעות הם קבוצה הטרודוגני של תאים, מה שהופך אותו מאתגר לנתח את הפונקציה שלהם מתמנת מפני מאפיינים מסתגלת pro-פיברוטיק. לאחרונה, הטרוגניות תפקודית של שני תת שונים בפיברוהפיצוץ בעקבות פציעה שריר הלב הוגדרו, המציין את האפשרות של בידוד שונים סוגי הפיצוץ בפיברומות ולימוד תפקידם בפצע ריפוי5.
קבלת האוכלוסייה טהור פיברוהפיצוץ הוא חיוני בתיחום התפקיד הפונקציונלי שלהם בתיקון פיברוזיס. עם זאת, הנוכחות של סמנים מרובים פיברומסט המכירים סוגי תאים אחרים להפוך אותו מאתגר לבודד את האוכלוסייה טהור באופן משמעותי הפיברובלסט6. מספר מחקרים אלגנטיים המציאו דרכים חכמות כדי לבודד פיברוהכדורים מפני שריר הלב נפצע ופצע. השיטה הפופולרית ביותר ומבוססת היטב של העשרת הגידולים היא דרך הדבקה סלקטיבית בעקבות עיכול הרקמה האנזימטית7.
בנוסף, מיון תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) של פיברותקיעות מבוסס על משטח תאים אנטיגנים שתוארו בהצלחה8. במחקר, בעקבות העיכול האנזימטי, התאים המסנכטיים ממוינים כשושלת שלילית (לין: Ter119-CD45-CD31-) וgp38-חיובי (gp38+)מלבבות העכבר. Gp38+ ve תאים אושרו להיות פיברופיצוצים מבוסס על שיתוף הביטוי שלהם של col1α1 וסמנים mesenchymal אחרים. למרות שרוב העיכול הרקמות מושלם לאחר שהוא מבתר את החדר בצלחת פטרי, מחקר שנערך לאחרונה חקר את השימוש במחט האנזים הישיר של החדר השמאלי כדי לבודד מיוציטים ולא מיאלוציטים אשר כוללים פיברופיצוצים9. במקרה זה בודלו באמצעות הדבקה סלקטיבית.
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד וההעשרה של הפיברותקיעות בשלוש שיטות. הראשונה היא שיטה מבוססת הכוללת הדבקה סלקטיבית של פיברומטיות בעקבות העיכול האנזימטי. השיטה השנייה משמש בעיקר בידוד פציעה המושרה אלפא שרירים המבטא מיופיברופיצוצים. השיטה השלישית כוללת רציפים, דלדול מגנטי של השעיית תאי לב אנזימים מתעכלים של תאי המטפאות ואנדותל. בעקבות דלדול, פיברותקיעות/מיופיברופיצוצים מבודדים מבוסס על נוכחות של אנטיגן MEFSK4 באמצעות חרוזים מגנטיים. לאחרונה, MEFSK4 תוארה כאנטיגן נוכח על השקט כמו גם הפעלת פיברותקיעות, מה שהופך אותו סמן מתאים לזיהוי פיברוהפיצוץ ובידוד. כמובן, לכל השיטות המתוארות כאן יש מגבלות ייחודיות. לכן מומלץ מאוד לבדוק את הטוהר של אוכלוסיית התאים המבודדים באמצעות ניתוח זרימה, כתמים, וכמותי למחצה-PCR בזמן אמת. עם זאת, ניתן להרחיב את המתודולוגיות הללו, וניתן להוסיף סמנים נוספים כדי שלא לכלול אוכלוסיות מזהם אחרות לפני ניצול הפיברוהפיצוץ ואוכלוסיות מיופיברומות לניסויים מכריעים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיברותקיעות הם קבוצה הטרודוגני של תאים, מזוהה על ידי קבוצה מגוונת של סמנים. סמני החלבון ששימשו לזיהוי פיברוהטיים הם discoidin לקולטן תחום 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, קולגן אני ו III, ו Thy115,16,17,18,19,20….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות ד ר איבו Kalajzic עבור העכברים αSMA-GFP. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים לבריאות (NIH) תחת הפרס מספר R01GM118300 (האס), המכון הלאומי להדמיה ביו-רפואית וביוהנדסה של NIH תחת הפרס מספר R21EB019509 (P.P.Y.), ומענק פיתוח המדען של איגוד הלב האמריקני תחת הפרס מספר 17SDG33630187 (אס). מנתח זרימה cy, בוצעו ב-VUMC זרימה Cy, משאב משותף אשר נתמך על ידי מרכז הסרטן של ואנדרבילט Ingram (P30 CA68485) ואת מחלת העיכול ואנדרבילט מרכז המחקר (DK058404).
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
Riferimenti
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
- Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
- Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
- Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
- Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
- Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
- Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
- Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
- Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).
