Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti
Summary
Ottenere una popolazione pura di fibroblasti è fondamentale per studiare il loro ruolo nella riparazione delle ferite e nella fibrosi. Descritto qui è un metodo dettagliato per isolare i fibroblasti e i miofibroblasti da cuori di topo feriti e feriti, seguiti dalla caratterizzazione della loro purezza e funzionalità da immunofluorescence, RTPCR, smistamento delle cellule assistite dalla fluorescenza, e contrazione del gel di collagene.
Abstract
La fibrosi cardiaca in risposta a lesioni è una risposta fisiologica alla guarigione delle ferite. Sono stati compiuti sforzi per studiare e colpire i sottotipi di fibroblasti che mitigano la fibrosi. Tuttavia, la ricerca sul fibroblasto è stata ostacolata a causa della mancanza di marcatori fibroblasti universalmente accettabili per identificare i fibroblasti quiescenti e attivati. I fibroblasti sono una popolazione cellulare eterogenea, che li rende difficili da isolare e caratterizzare. Il protocollo presentato descrive tre diversi metodi per arricchire i fibroblasti e i miofibroblasti dai cuori dei topi illesi e feriti. L’utilizzo di un protocollo standard e affidabile per isolare i fibroblasti consentirà lo studio dei loro ruoli nell’omeostasi e nella modulazione della fibrosi.
Introduction
I fibroblasti cardiaci, cellule di origine mesenchymica, svolgono un ruolo significativo nel mantenimento della conduzione elettrica e delle forze meccaniche nel cuore oltre al mantenimento dell’architettura cardiaca durante l’omeostasi1. A seguito di lesioni, queste cellule vengono attivate, espanse e producono proteine a matrice extracellulare (ECM)2. Molti studi preclinici hanno rivelato i fibroblasti come regolatori cellulari critici che mantengono l’integrità strutturale di un cuore ferito3 così come le principali cellule efanti responsabili della produzione incontrollata e della deposizione delle proteine ECM, con conseguente formazione rigida di cicatrici e insufficienza cardiaca4. I fibroblasti sono un gruppo eterogeneo di cellule, il che rende difficile sezionare la loro funzione riparativa da proprietà maladattive pro-fibrotiche. Recentemente, è stata definita l’eterogeneità funzionale di due distinti sottotipi fibroblasti a seguito di lesioni miocardiche, indicando la possibilità di isolare diversi sottotipi di fibrolazione e studiare il loro ruolo nella guarigione delle ferite5.
Ottenere una popolazione fibroblasta pura è fondamentale per delineare il loro ruolo funzionale nella riparazione e nella fibrosi. Tuttavia, la presenza di più marcatori fibroblasti che riconoscono altri tipi di cellule rendono difficile isolare una popolazione fibroblasta sostanzialmente pura6. Diversi studi eleganti hanno escogitato modi intelligenti per isolare i fibroblasti cardiaci dal miocardio illeso e ferito. Il metodo più popolare e consolidato per arricchire i fibroblasti è attraverso l’adesione selettiva dopo la digestione del tessuto enzimatico7.
Inoltre, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) di fibroblasti basati su antigeni della superficie cellulare è stato descritto con successo8. Nello studio, a seguito della digestione ezimatica, le cellule mesenchymal sono state ordinate come lignaggio-negativo (Lin: Ter119–CD45–CD41)e gp38-positivo (gp38)dal cuore del mouse. Lecellule gp38 sono state confermate come fibroblaste basate sulla loro co-espressione di col1-1 e di altri marcatori mesenchymici. Anche se la maggior parte della digestione tissutale è completata dopo aver sezionato il ventricolo in un piatto di Petri, un recente studio ha studiato l’uso di una perfusione diretta dell’enzima dell’ago sinistro del ventricolo sinistro per isolare i miociti e i non miociti che includono fibroblasti9. I fibroblasti sono stati poi isolati per adesione selettiva in questo caso.
Questo protocollo descrive l’isolamento e l’arricchimento dei fibroblasti utilizzando tre metodi. Il primo è un metodo già stabilito che prevede l’adesione selettiva dei fibroblasti a seguito della digestione enzimatica. Il secondo metodo viene utilizzato per isolare principalmente il muscolo alfa liscio indotto da lesioni che esprime miofibroblasti. Il terzo metodo prevede l’esaurimento magnetico sequenziale di una sospensione cellulare cardiaca di ematopoietiche ed endoteliale. In seguito all’esaurimento, i fibroblasti/miofibroblasti sono isolati in base alla presenza dell’antigene MEFSK4 utilizzando perline magnetiche. Recentemente, MEFSK4 è stato descritto come un antigene presente sui fibroblasti quiescenti e attivati, rendendolo un marcatore adatto per l’identificazione e l’isolamento del fibroblasto. Naturalmente, tutti i metodi qui descritti hanno limitazioni uniche. Si raccomanda quindi di verificare la purezza della popolazione di cellule isolate mediante analisi del flusso, immunostaining e PCR semi-quantitativo in tempo reale. Tuttavia, queste metodologie possono essere ampliate, e ulteriori marcatori possono essere aggiunti al fine di escludere altre popolazioni contaminate prima di utilizzare le popolazioni di fibroblasti e miofibromi per esperimenti cruciali.
Protocol
Representative Results
Discussion
I fibroblasti sono un gruppo eterogeneo di cellule, identificato da diversi indicatori. I marcatori proteici che sono stati utilizzati per identificare i fibroblasti sono il recettore del dominio discoidina 2 (DDR2), la fibronectina, la vimentina, il collagene I e III e Thy115,16,17,18,19,20. Mentre la vimentina è stata util…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vogliono ringraziare il Dr. Ivo Kalajzic per i topi sMA-GFP. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health (NIH) con il Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the NIH sotto Il numero R21EB019509 (P.P.Y.) e lo Scientist Development Grant dell’American Heart Association sotto il numero 17SDG3630187 (S.S.). Le analisi della citometria di flusso sono state eseguite presso il VUMC Flow Cytometry Shared Resource, supportato dal Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) e dal Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
Riferimenti
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