成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け
Summary
線維芽細胞の純粋な集団を得ることは、創傷修復および線維化におけるその役割を研究するために重要である。ここでは、線維芽細胞と筋線維芽細胞を、傷つけていないマウスの心臓から分離し、その後、免疫蛍光、RTPCR、蛍光支援細胞選別による純度と機能性の特徴付け、およびコラーゲンゲル収縮。
Abstract
傷害に応答した心臓線維症は、創傷治癒に対する生理学的応答である。線維症を軽減する線維芽細胞サブタイプを研究し、標的にするための努力がなされている。しかし、線維芽細胞の研究は、活性化線維芽細胞と同様に静止を同定するために普遍的に許容される線維芽細胞マーカーの欠如のために妨げられてきた。線維芽細胞は異種細胞集団であり、分離して特徴付けることを困難にする。提示されたプロトコルは、傷つけていないマウスの心臓から線維芽細胞および筋線維芽細胞を豊かにする3つの異なる方法を記述する。標準的で信頼性の高いプロトコルを使用して線維芽細胞を分離することで、ホメオスタシスと線維症変調における役割の研究が可能になります。
Introduction
心臓線維芽細胞は、間葉起源の細胞、ホメオスタシス中の心臓アーキテクチャの維持に加えて心臓における電気伝導および機械的力を維持する上で重要な役割を果たす1。傷害後、これらの細胞は活性化され、増殖し、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質2を産生する。多くの前臨床試験では、負傷した心臓3の構造的完全性を維持する重要な細胞レギュレータとして線維芽細胞が明らかになり、ECMタンパク質の未チェック産生および堆積を担う主なエフェクター細胞が、硬い瘢痕形成および心不全4を引き起こした。線維芽細胞は細胞の異種グループであり、線維化不適応性から修復機能を解剖することは困難です。近年、心筋損傷後の2つの異なる線維芽細胞サブタイプの機能的不均一性が定義されており、異なる線維芽細胞サブタイプを単離し、創傷治癒におけるそれらの役割を研究する可能性を示す5。
純粋な線維芽細胞集団を得ることは、修復および線維化における機能的役割をデリデートする上で極めて重要である。しかし、他の細胞型を認識する複数の線維芽細胞マーカーの存在は、実質的に純粋な線維芽細胞集団6を単離することが困難となる。いくつかのエレガントな研究は、怪我をしていない心筋症や負傷した心筋から心臓線維芽細胞を分離する巧妙な方法を考案しました。線維芽細胞を濃縮する最も一般的かつ確立された方法は、酵素組織消化に続く選択的接着を介してである 7.
また、細胞表面抗原に基づく線維芽細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)が8に記載され、正常に説明されている。この研究では、酵素消化に続いて、間葉系細胞を、マウスの心臓から系統陰性(Lin: Ter119–CD45 –CD31−)およびgp38陽性(gp38+)としてソートした。−+Gp38+ve細胞は、col1α1および他の間葉マーカーのそれらの共発現に基づいて線維芽細胞であることが確認された。ほとんどの組織消化はペトリ皿の中で心室を解剖した後に完了するが、最近の研究では、線維芽細胞を含む筋細胞および非筋細胞を単離するために左心室の直接針酵素灌流の使用を調査した。次いで線維芽細胞を選択的接着によってこの場合に単離した。
このプロトコルは、3つの方法を用いた線維芽細胞の分離および濃縮について説明する。1つ目は、酵素消化後の線維芽細胞の選択的接着を含む既に確立された方法である。第2の方法は、主に筋線維芽細胞を発現する傷害誘発アルファ平滑筋を単離するために使用される。第3の方法は、造血細胞および内皮細胞の酵素消化心細胞懸濁液の逐次的な磁気枯渇を伴う。枯渇後、線維芽細胞/筋線維芽細胞は、磁気ビーズを使用して抗原MEFSK4の存在に基づいて単離される。近年、MEFSK4は、活性化線維芽細胞と同様に静止症に存在する抗原として説明されており、線維芽細胞の同定および単離に適したマーカーとなっています。当然ながら、ここで説明するすべての方法には固有の制限があります。したがって、フロー解析、免疫染色、および半定量的リアルタイムPCRにより、単離された細胞集団の純度を確認することを強くお勧めします。しかし、これらの方法論は、上に拡大することができ、重要な実験のために線維芽細胞および筋線維芽細胞集団を利用する前に、他の汚染集団を除外するために追加のマーカーを追加することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
線維芽細胞は、細胞の異種群であり、多様なマーカーの集合によって同定される。線維芽細胞の同定に用いられてきたタンパク質マーカーは、フィディスコジジンドメイン受容体2(DDR2)、フィブロネクチン、ビメンチン、コラーゲンIおよびIII、およびthy1 15、16、17、18、19、20である。15,16,17,18,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、αSMA-GFPマウスに対するイヴォ・カラジッチ博士に感謝したいと考えています。本論文で報告された研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所(NIH)が、NIHの国立生物医学イメージング・バイオエンジニアリング研究所の賞番号R01GM118300(S.S.)の下で支援を受けました。賞番号R21EB019509(P.P.Y.)、および賞番号17SDG33630187(S.S.)の下で米国心臓協会の科学者育成助成金の下で。フローサイトメトリー分析は、ヴァンダービルト・イングラムがんセンター(P30 CA68485)とヴァンダービルト消化器疾患研究センター(DK058404)が支援するVUMCフローサイトメトリー共有リソースで行われました。
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
Riferimenti
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