Isolasjon og karakterisering av voksen hjertefibroblaster og myofibroblaster
Summary
Å skaffe seg en ren populasjon av fibroblaster er avgjørende for å studere sin rolle i sårreparasjon og fibrose. Beskrevet her er en detaljert metode for å isolere fibroblaster og myofibroblaster fra uskadet og skadet musehjerter etterfulgt av karakterisering av deres renhet og funksjonalitet ved immunofluorescence, RTPCR, fluorescensassistert cellesortering, og kollagen gel sammentrekning.
Abstract
Hjertefibrose som svar på skade er en fysiologisk respons på sårheling. Det er gjort forsøk på å studere og målrette fibroblastsubtyper som reduserer fibrose. Fibroblastforskning har imidlertid blitt hindret på grunn av mangel på universelt akseptable fibroblastmarkører for å identifisere quiescent samt aktiverte fibroblaster. Fibroblaster er en heterogen cellepopulasjon, noe som gjør dem vanskelige å isolere og karakterisere. Den presenterte protokollen beskriver tre forskjellige metoder for å berike fibroblaster og myofibroblaster fra uskadede og skadde musehjerter. Ved hjelp av en standard og pålitelig protokoll for å isolere fibroblaster vil gjøre det mulig å studere sine roller i homeostase samt fibrose modulasjon.
Introduction
Hjertefibroblaster, celler av mesenchymal opprinnelse, spiller en betydelig rolle i å opprettholde den elektriske ledning og mekaniske krefter i hjertet i tillegg til vedlikehold av hjertearkitektur under homeostase1. Etter skade aktiveres, utvides disse cellene og produserer ekstracellulære matriseproteiner (ECM)proteiner 2. Mange prekliniske studier har avdekket fibroblaster som kritiske cellulære regulatorer som opprettholder den strukturelle integriteten til et skadet hjerte3, samt hovedeffektorceller som er ansvarlige for ukontrollert produksjon og avsetning av ECM-proteiner, noe som resulterer i stiv arrdannelse og hjertesvikt4. Fibroblaster er en heterogen gruppe celler, noe som gjør det utfordrende å dissekere deres reparative funksjon fra pro-fibrotiske maladaptive egenskaper. Nylig har den funksjonelle heterogeniteten til to forskjellige fibroblastsubtyper etter myokardskade blitt definert, noe som indikerer muligheten for å isolere forskjellige fibroblastsubtyper og studere deres rolle i sårheling5.
Å skaffe en ren fibroblastpopulasjon er avgjørende for å fordype sin funksjonelle rolle i reparasjon og fibrose. Imidlertid gjør tilstedeværelsen av flere fibroblastmarkører som gjenkjenner andre celletyper det utfordrende å isolere en vesentlig ren fibroblastpopulasjon6. Flere elegante studier har utviklet smarte måter å isolere hjertefibroblaster fra uskadet og skadet myokardiet. Den mest populære og veletablerte metoden for berikende fibroblaster er gjennom selektiv vedheshet etter enzymatisk vevfordøyelse7.
I tillegg har fluorescensaktivert cellesortering (FACS) av fibroblaster basert på celleoverflateantigener blitt beskrevet8. I studien, etter enzymatisk fordøyelse, ble mesenchymale cellene sortert som avstamningsnegative (Lin: Ter119−CD45−CD31−) og gp38-positiv (gp38+) fra mushjerter. Gp38+ve celler ble bekreftet å være fibroblaster basert på deres co-uttrykk for col1α1 og andre mesenchymal markører. Selv om de fleste vev fordøyelsen er fullført etter dissekere ut ventrikkelen i en Petri parabolen, en nylig studie har undersøkt bruk av en direkte nål enzym perfusjon av venstre ventrikkel for å isolere myocytter og ikke-myocytter som inkluderer fibroblaster9. Fibroblaster ble deretter isolert av selektiv vedhehesjon i dette tilfellet.
Denne protokollen beskriver isolasjon og berikelse av fibroblaster ved hjelp av tre metoder. Den første er en allerede etablert metode som involverer selektiv vedhesjon av fibroblaster etter enzymatisk fordøyelse. Den andre metoden brukes til primært å isolere skadeindusert alfa glatt muskel som uttrykker myofibroblaster. Den tredje metoden innebærer sekvensiell, magnetisk uttømming av en enzymfordøyd hjertecellesuspensjon av hematopoetiske og endotelceller. Etter uttømming isoleres fibroblaster/myofibroblaster basert på tilstedeværelsen av antigenet MEFSK4 ved hjelp av magnetiske perler. Nylig har MEFSK4 blitt beskrevet som et antigen til stede på quiescent samt aktiverte fibroblaster, noe som gjør det til en passende markør for fibroblastidentifikasjon og isolasjon. Naturligvis har alle metodene som er beskrevet her unike begrensninger. Det anbefales derfor sterkt å kontrollere renheten til den isolerte cellepopulasjonen ved strømningsanalyse, immunfarging og semikvantitativ sanntids PCR. Imidlertid kan disse metodene utvides, og flere markører kan legges til for å utelukke andre forurensende populasjoner før du bruker fibroblast og myofibroblastpopulasjoner for avgjørende eksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fibroblaster er en heterogen gruppe celler, identifisert av ulike sett med markører. Protein markører som har blitt brukt til å identifisere fibroblaster er discoidin domene reseptor 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, kollagen I og III, og Thy115,16,17,18,19,20. Mens vimentin har blitt brukt til å identifisere uskadet quies…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Dr. Ivo Kalajzic for αSMA-GFP-musene. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences ved National Institutes of Health (NIH) under Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering av NIH under Award Number R21EB019509 (P.P.Y.), og Forsker Development Grant av American Heart Association under Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow cytometri analyser ble utført på VUMC Flow Cytometry Shared Resource som støttes av Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) og Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
Riferimenti
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
- Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
- Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
- Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
- Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
- Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
- Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
- Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
- Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).
