Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos
Summary
A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para estudar seu papel na reparação de feridas e fibrose. Descrito aqui é um método detalhado para isolar fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos seguido susceptência de sua pureza e funcionalidade por imunofluorescência, RTPCR, triagem celular assistida por fluorescência, e contração de gel de colágeno.
Abstract
Fibrose cardíaca em resposta à lesão é uma resposta fisiológica à cicatrização de feridas. Esforços têm sido feitos para estudar e direcionar subtipos de fibroblastos que mitigam a fibrose. No entanto, a pesquisa de fibroblastos tem sido dificultada devido à falta de marcadores de fibroblastos universalmente aceitáveis para identificar quiescentes, bem como fibroblastos ativados. Os fibroblastos são uma população de células heterogêgenas, tornando-os difíceis de isolar e caracterizar. O protocolo apresentado descreve três métodos diferentes para enriquecer fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos. O uso de um protocolo padrão e confiável para isolar fibroblastos permitirá o estudo de seus papéis na homeostase, bem como na modulação da fibrose.
Introduction
Fibroblastos cardíacos, células de origem mesenquimal, desempenham um papel significativo na manutenção da condução elétrica e forças mecânicas no coração, além da manutenção da arquitetura cardíaca durante a homeostase1. Após a lesão, essas células são ativadas, expandem e produzem proteínas de matriz extracelular (ECM)2. Muitos estudos pré-clínicos revelaram os fibroblastos como reguladores celulares críticos que mantêm a integridade estrutural de um coração ferido3, bem como as principais células eficazes responsáveis pela produção e deposição de proteínas ECM não controladas, resultando em formação de cicatrizes rígidas e insuficiência cardíaca4. Os fibroblastos são um grupo heterogêneo de células, tornando desafiador dissecar sua função reparadora de propriedades antiadaptativas pró-fibroticas. Recentemente, foi definida a heterogeneidade funcional de dois subtipos distintos de fibroblastos após lesão do miocárdio, indicando a possibilidade de isolar diferentes subtipos de fibroblastos e estudar seu papel na cicatrização de feridas5.
A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para delinear seu papel funcional na reparação e fibrose. No entanto, a presença de múltiplos marcadores de fibroblastos que reconhecem outros tipos de células torna difícil isolar uma população de fibroblastos substancialmente pura6. Vários estudos elegantes criaram maneiras inteligentes de isolar fibroblastos cardíacos de miocárdio ileso e ferido. O método mais popular e bem estabelecido de enriquecer fibroblastos é através de adesão seletiva após digestão de tecido enzimático7.
Além disso, a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de fibroblastos baseados em antígenos de superfície celular foi descrita com sucesso8. No estudo, após a digestão enzimática, as células mesenquimais foram classificadas como linhagem-negativa (Lin: Ter119−CD45−CD31−) e gp38-positivo (gp38+) de corações de rato. As células Gp38+ve foram confirmadas como fibroblastos com base em sua co-expressão de col1α1 e outros marcadores mesenquimais. Embora a maior parte da digestão tecidual seja concluída após dissecar o ventrículo em uma placa de Petri, um estudo recente investigou o uso de uma perfusão direta de enzima de agulha do ventrículo esquerdo para isolar miócitos e não-miócitos que incluem fibroblastos9. Os fibroblastos foram então isolados por adesão seletiva neste caso.
Este protocolo descreve o isolamento e o enriquecimento de fibroblastos usando três métodos. O primeiro é um método já estabelecido envolvendo a adesão seletiva de fibroblastos após digestão enzimática. O segundo método é usado para isolar principalmente o músculo alfa liso induzido por lesões expressando miofibroblastos. O terceiro método envolve o esgotamento sequencial e magnético de uma suspensão celular cardíaca digerida por enzimas de células hematopoiéticas e endoteliais. Após o esgotamento, fibroblastos/miofibroblastos são isolados com base na presença do antígeno MEFSK4 usando contas magnéticas. Recentemente, MEFSK4 foi descrito como um antígeno presente em quiescente, bem como fibroblastos ativados, tornando-se um marcador adequado para identificação e isolamento de fibroblastos. Naturalmente, todos os métodos descritos aqui têm limitações únicas. Por isso, é altamente recomendável verificar a pureza da população celular isolada por análise de fluxo, imunocoloração e PCR semi-quantitativo em tempo real. No entanto, essas metodologias podem ser expandidas, e marcadores adicionais podem ser adicionados a fim de excluir outras populações contaminantes antes de utilizar as populações de fibroblastos e miofibroblastos para experimentos cruciais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os fibroblastos são um grupo heterogêneo de células, identificados por diversos conjuntos de marcadores. Os marcadores proteicos utilizados para identificar fibroblastos são receptor de domínio de discoidin a 2 (DDR2), fibronectina, vimentina, colágeno I e III, e Thy115,16,17,18,19,20. Considerando que a vimentina tem s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores querem agradecer ao Dr. Ivo Kalajzic pelos ratos αSMA-GFP. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) o número de prêmio R01GM118300 (S.S.), Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia do NIH o número de prêmio R21EB019509 (P.P.Y.), e Prêmio de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association o número de prêmio 17SDG33630187 (S.S.). As análises de citometria de fluxo foram realizadas no Recurso Compartilhado de Citometria do Fluxo VUMC, que é apoiado pelo Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) e pelo Centro de Pesquisa de Doenças Digestivas vanderbilt (DK058404).
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
Riferimenti
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