Isolering och karakterisering av vuxna hjärtfibroblaster och Myofibroblaster
Summary
Att få en ren population av fibroblaster är avgörande för att studera deras roll i sår reparation och fibros. Beskrivs här är en detaljerad metod för att isolera fibroblaster och myofibroblaster från oskadade och skadade mus hjärtan följt av karakterisering av deras renhet och funktionalitet genom immunfluorescens, RTPCR, fluorescensassisterad cell sortering, och kollagengelkontraktion.
Abstract
Hjärtfibros som svar på skada är en fysiologisk reaktion på sårläkning. Ansträngningar har gjorts för att studera och rikta fibroblast subtyper som mildrar fibros. Emellertid, fibroblast forskning har hindrats på grund av bristen på universellt acceptabla fibroblast markörer för att identifiera quiescent samt aktiverade fibroblaster. Fibroblaster är en heterogen cellpopulation, vilket gör dem svåra att isolera och karakterisera. Det presenterade protokollet beskriver tre olika metoder för att berika fibroblaster och myofibroblaster från oskadade och skadade mushjärtan. Med hjälp av en standard och pålitlig protokoll för att isolera fibroblaster kommer att möjliggöra studier av deras roller i homeostas samt fibros modulering.
Introduction
Hjärt fibroblaster, celler av mesenkymala ursprung, spelar en viktig roll för att upprätthålla den elektriska ledning och mekaniska krafter i hjärtat förutom underhåll av hjärtarkitektur under homeostas1. Efter skada aktiveras, expanderas och produceras ecm-proteiner (extracellulärt matris)2. Många prekliniska studier har visat fibroblaster som kritiska cellulära tillsynsmyndigheter som upprätthåller den strukturella integriteten hos ett skadat hjärta3 samt huvudeffektorceller som ansvarar för okontrollerad produktion och nedfall av ECM-proteiner, vilket resulterar i stel ärrbildning och hjärtsvikt4. Fibroblaster är en heterogen grupp av celler, vilket gör det utmanande att dissekera deras reparativ funktion från pro-fibrotic maladaptiva egenskaper. Nyligen har den funktionella heterogeniteten hos två distinkta fibroblast subtyper efter hjärtinfarkt skada definierats, vilket tyder på möjligheten att isolera olika fibroblast subtyper och studera deras roll i sårläkning5.
Att få en ren fibroblast befolkningen är avgörande för att delineating deras funktionella roll i reparation och fibros. Förekomsten av flera fibroblast markörer som känner igen andra celltyper gör det svårt att isolera en väsentligen ren fibroblast population6. Flera eleganta studier har utarbetat smarta sätt att isolera hjärt fibroblaster från oskadade och skadade hjärtmuskeln. Den mest populära och väletablerade metoden för berikande fibroblaster är genom selektiv vidhäftning efter enzymatisk vävnad matsmältning7.
Dessutom har fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) av fibroblaster baserade på cellytantigener framgångsrikt beskrivits8. I studien, efter enzymatisk matsmältning, sorterades mesenkymala cellerna som härstamningsnegativa (Lin: Ter119−CD45−CD31−) och gp38-positiva (gp38+) från mushjärtan. Gp38+ve celler bekräftades vara fibroblaster baserat på deras samuttryck av col1α1 och andra mesenkymala markörer. Även om de flesta vävnad matsmältningen är klar efter dissekera ut ventrikeln i en Petri maträtt, en färsk studie har undersökt användningen av en direkt nål enzym perfusion av den vänstra ventrikeln för att isolera myocyter och icke-myocyter som inkluderar fibroblaster9. Fibroblaster isolerades sedan av selektiv vidhäftning i detta fall.
Detta protokoll beskriver isolering och anrikning av fibroblaster med hjälp av tre metoder. Den första är en redan etablerad metod som involverar selektiv vidhäftning av fibroblaster efter enzymatisk matsmältning. Den andra metoden används för att främst isolera skada-inducerad alfa glatt muskulatur uttrycker myofibroblaster. Den tredje metoden innebär sekventiell, magnetisk utarmning av en enzym-smält hjärtcell suspension av hematopoietic och endotelceller. Efter utarmning isoleras fibroblaster/myofibroblaster baserat på förekomsten av antigenet MEFSK4 med hjälp av magnetiska pärlor. Nyligen har MEFSK4 beskrivits som ett antigen som finns på quiescent samt aktiverade fibroblaster, vilket gör det till en lämplig markör för fibroblast identifiering och isolering. Naturligtvis har alla metoder som beskrivs här unika begränsningar. Det rekommenderas därför starkt att kontrollera renhet isolerade cellpopulationen genom flödeanalys, immunfärgning och semikvantitativ realtid PCR. Dessa metoder kan dock utökas, och ytterligare markörer kan läggas till för att utesluta andra förorenande populationer innan de använder fibroblast och myofibroblast populationer för avgörande experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fibroblaster är en heterogen grupp av celler, identifieras av olika uppsättning markörer. De proteinmarkörer som har använts för att identifiera fibroblaster är discoidin domänreceptor 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, kollagen I och III, och Thy115,16,17,18,19,20.18 Medan vimentin har använts för att identifiera osk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Ivo Kalajzic för αSMA-GFP möss. Forskning som rapporterats i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health (NIH) under Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the NIH under Award Number R21EB019509 (P.P.Y.) och Scientist Development Grant of the American Heart Association under Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flödecytometri analyser utfördes vid VUMC Flow Cytometri Delad resurs som stöds av Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) och Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
Riferimenti
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
- Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
- Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
- Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
- Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
- Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
- Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
- Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
- Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).
