공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성
Summary
본 명세서에서, 우리는 올리고엔드로시트의 정제 및 공동 배양 실험에 사용될 수 있는 올리고엔드로시테 컨디셔닝 배지의 생산을 위한 효율적인 방법을 전시한다.
Abstract
중추 신경계에서 올리고엔드로시트는 축삭 수초화에서 자신의 역할로 잘 알려져 있으며, 이는 염전을 통해 행동 잠재력의 전파를 가속화합니다. 더욱이, 보고의 증가 수는 oligodendrocytes가 특히 가용성 요인의 분비를 통해, myelination를 넘어 뉴런과 상호 작용한다는 것을 건의합니다. 여기에서, 우리는 또한 성상 세포 및 microglial 세포를 포함하는 신경교 세포 배양에서 oligodendroglial 계보 세포의 정제를 허용하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 37 °C에서 하룻밤 흔들림에 의존, 이는 오버 리올리고겐드로글리알 세포와 미세 교만 세포의 선택적 분리를 허용, 차등 접착에 의해 미세 글리아의 제거. 그런 다음 올리고엔드로시트의 문화와 올리고엔드로시테(oligodendrocyte) 조절 배지(OCM)의 생산을 설명합니다. 우리는 또한 공동 문화 실험에서 정제 된 해마 뉴런에 추가 된 OCM 치료 또는 올리고 덴 드 로시테의 역학을 제공, 올리고 덴 드 로시테 – 뉴런 상호 작용을 연구.
Introduction
올리고엔드로시트(OLs)는 축삭 주위의 미엘린을 생성하는 중추신경계(CNS)의 신경교 세포이다. 올Ls는 배아 CNS의 심실 영역 내에서 증식한 후 완전히 성숙한 올(즉, 미엘린 형성 세포)로 이동하고 분화하는 올리고엔드로시테 전구체 세포(OPCs)에서 유래합니다1. OPCs는 초기 발달 도중 풍부합니다, 그러나 또한 중요한 증식 세포 인구를 대표하는 성인 두뇌에서 지속합니다2. 하나의 OL은 흥분되지 않는 단면(즉, 인터노드)에서 다중 축삭을 ensheathes하고, 각 myelin 루프의 가장자리는 미엘린1,3의절연 특성에 중요한 편집증 도메인을 형성하는 축삭에 부착된다. 파라노드 사이에는 Ranvier의 노드라고 불리는 작은 미수화 된 간격이 있습니다. 이러한 노드는 전압 게이트 나트륨 채널 (Nav)이 풍부하여 염전도4를통해 작용 전위를 재생하고 신속하게 전파 할 수 있습니다. 이 단단한 상호 작용은 또한 OLs5,6에서젖산의 신경 관내 섭취를 통해 축축한 에너지 지원을 가능하게 합니다.
올리고드로글리알 혈통 세포와 수레화 과정의 성숙은 뉴런과의 상호 작용에 의해 엄격하게 조절된다7. 실제로, NG2 세포라고도 불리는 OPC와 OPCs는 신경 전달 물질에 대한 수용체의 배열을 발현하고, 흥분성 및 억제 뉴런으로부터 입력을 수신할 수 있어, 이들의 증식 및/또는 분화 세포를 분화시킬 수 있는 뉴런 활동을 감지할 수 있도록2. 차례로, OPCs/OLs는 마이크로소포스와 단백질을 세포외 공간으로 분비하며 이는 단독으로 또는 상승적으로 신경조절 및 신경보호 기능을8,9,10,11,12. 그러나, oligodendroglial 혈통 세포와 뉴런 사이 상호 작용의 다중 모드를 통제하는 분자 기계장치는 아직 완전히 해독될 수 있습니다.
더욱이, 몇몇 CNS 병리학 적인 조건에서, 올은 주로 영향을 받습니다, 따라서 뉴런과의 상호 작용을 방해하. 예를 들면, 다발성 경화증에서 (MS), 신경 기능 장애는 축삭 손상 및 관련 무력 축적으로 이끌어 낼 수 있는 CNC에 있는 초점 탈수아비, 이차 적인 OLs 손실에 기인합니다. 레미엘리네이션은 대부분의 경우13. 면역 요법의 발달로 인해 지난 10 년 동안의 진전은 재발률을 감소시키지만 재수elination을 촉진하는 것은 충족되지 않은 필요성으로 남아 있습니다. 이와 같이, OLs 역할, 기능 및 영향의 더 나은 이해는 CNS 조건의 넓은 스펙트럼을 위한 새로운 치료의 발달에 특히 관심있습니다.
여기서, 우리는 올스 정제 및 배양의 방법을 설명합니다. 이를 통해 개발 및 생물학을 규제하는 본질적인 메커니즘을 정밀하게 검사할 수 있습니다. 또한, 이러한 고농축 된 올스 배양은 뉴런 생리학 및 연결에 대한 OLs 분비 요인의 영향에 대한 통찰력을 얻기 위해 정제 된 뉴런 문화에 추가 할 수있는 oligodendrocyte 컨디셔닝 배지 (OCM)의 생산을 허용합니다. 또한, 우리는 정제 된 올리고 엔드 로시테와 뉴런이 함께 결합되어 조절 되는 메커니즘을 해결할 수있는 체외 공동 배양 시스템을 구현하는 방법을 설명합니다 (재)myelination.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 우리는 혼합 신경교 배양으로부터 고도로 농축된 올리고덴드로글리알 계보 세포 배양체를 얻기 위한 상세한 프로토콜을 제공하며, 이전에 발표된 방법16으로부터적응하고, OL-컨디셔닝 배지의 후속 생산을 제공한다. 이러한 흔들림 기술은 비용이 많이 들이지 않고, 3회 반복될 수 있으며, PDGFα를 함유하는 보텐슈타인-사토(BS) 배지에서 배양된 세포로서 다량의 정제된 올?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원고 편집에 대한 그의 현명한 조언에 대한 레미 론자노에게 감사드립니다. 이 작품은 ICM, INSERM, NSF에 ARSEP 재단 보조금, 부베 라브루예르 가격에 의해 지원되었다.
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
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