Generation af Oligodendrocytes og Oligodendrocyte-Conditioned Medium for co-kultur eksperimenter
Summary
Heri viser vi en effektiv metode til rensning af oligodendrocytes og produktion af oligodendrocyte-konditioneret medium, der kan bruges til co-kultur eksperimenter.
Abstract
I centralnervesystemet er oligodendrocytes kendt for deres rolle i axon myelination, der fremskynder udbredelsen af handlingspotentialer gennem saltatoring. Desuden tyder et stigende antal rapporter på, at oligodendrocytes interagerer med neuroner ud over myelination, især gennem udskillelsen af opløselige faktorer. Her præsenterer vi en detaljeret protokol, der gør det muligt at rense oligodendroglial afstamningsceller fra gliacellekulturer, der også indeholder astrocytter og mikroglielle celler. Metoden er afhængig af natten ryster ved 37 °C, som giver mulighed for selektiv løsrivelse af de overliggende oligodendroglile celler og mikroglielle celler, og fjernelse af mikroglia ved differential vedhæftning. Vi beskriver derefter kulturen i oligodendrocytes og produktion af oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). Vi leverer også kinetik ocm behandling eller oligodendrocytes ud til renset hippocampal neuroner i co-kultur eksperimenter, studere oligodendrocyte-neuron interaktioner.
Introduction
Oligodendrocytes (OLs) er glielle celler i centralnervesystemet (CNS), der genererer myelin indpakning omkring axoner. OLs stammer fra oligodendrocyte prækursorceller (OPC’er), som formerer sig inden for de ventrikulære zoner i embryonale CNS og derefter migrerer og differentieres til fuldt modne OP’er (dvs. myelindannende celler)1. OPCs er rigelige i den tidlige udvikling, men også fortsætter i den voksne hjerne, hvor de repræsenterer de store proliferative celle population2. En enkelt OL beskærer flere axoner i ikke-excitable sektioner (dvs. internoder), og kanten af hver myelin loop tillægger axon danner paranodal domæne, som er afgørende for isolerende egenskaber myelin1,3. I mellem paranoder er små umyelinerede huller kaldet noder ranvier. Disse noder er rige på spændingsgated natriumkanaler (Nav), der gør det muligt at regenerering og hurtig udbredelse af handlingspotentialer gennem saltatoring4. Denne tætte interaktion muliggør også axonal energistøtte gennem neuronal optagelse af laktat fra OLs5,6.
Modning af oligodendroglial afstamning celler og myelination proces er stramt reguleret af deres interaktioner med neuroner7. Faktisk, OLs og OPCs, også kaldet NG2 celler, udtrykke en række receptorer for neurotransmittere, og kan modtage input fra excitatoriske og hæmmende neuroner, giver dem mulighed for at fornemme neuronal aktivitet, der kan udløse deres spredning og / eller differentiering i myelinating celler2. Til gengæld udskiller OPCs/OLs mikrovesikler og proteiner ind i det ekstracellulære rum, som alene eller synergistisk mediat mægle neuromodulative og neuroprotektive funktioner8,9,10,11,12. Men de molekylære mekanismer, der styrer de mange former for interaktioner mellem oligodendroglial afstamning celler og neuroner er endnu ikke fuldt dechifreret.
Desuden, i flere CNS patologiske tilstande, ER OLs primært påvirket, hvilket forstyrrer deres interaktion med neuroner. For eksempel, i multipel sklerose (MS), neurologisk dysfunktion er forårsaget af fokal demyelinering i CNS, sekundært til OLs tab, der kan føre til axonale skader og relaterede handicap ophobning. Remyelination kan finde sted, om end utilstrækkeligt i de fleste tilfælde13. Fremskridt i det sidste årti har på grund af udviklingen af immunterapier reduceret tilbagefaldsraten, men at fremme remyelinnation er fortsat et udækket behov. Som sådan er en bedre forståelse af OP’ers rolle, funktioner og indflydelse af særlig interesse for udviklingen af nye behandlingsformer for et bredt spektrum af CNS-betingelser.
Her beskriver vi metoderne til OP’er rensning og kultur. Dette muliggør en præcis undersøgelse af iboende mekanismer, der regulerer deres udvikling og biologi. Desuden tillader sådanne højt berigede OLs-kulturer produktionen af oligodendrocyte-conditioned medium (OCM), som kan føjes til rensede neuronkulturer for at få indsigt i virkningen af OLs-udskillede faktorer på neuronal fysiologi og konnektivitet. Desuden beskriver vi, hvordan man implementerer et in vitro-co-kultursystem, hvor renset oligodendrocytes og neuroner kombineres sammen, så de kan håndtere de mekanismer, der regulerer (re)myelination.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her giver vi en detaljeret protokol for at opnå højt berigede oligodendroglial afstamning cellekulturer fra blandede gliakulturer, tilpasset fra en tidligere offentliggjort metode16, og den efterfølgende produktion af OL-betinget medium. Denne rysteteknik er ikke dyr, kan gentages tre gange og er optimal til at opnå en stor mængde rensede O’er, da celler, der dyrkes i Bottenstein-Sato (BS) medium, der indeholder PDGFα, formeresig. Glial celler er forberedt ved hjælp af cerebralcortices af W…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Rémi Ronzano for hans kloge råd i manuskriptredigering. Dette arbejde blev finansieret af ICM, INSERM, ARSEP foundation grant til NSF og Bouvet-Labruyère pris.
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
Riferimenti
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
