Qui, esponiamo un metodo efficiente per la purificazione degli oligodendrociti e la produzione di mezzo con condizioni oligodendrocite che possono essere utilizzati per esperimenti di co-cultura.
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Articolo metodologico
Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nel sistema nervoso centrale, gli oligodendrociti sono ben noti per il loro ruolo nella mielinazione degli assoni, che accelera la propagazione dei potenziali d'azione attraverso la conduzione saltatoria. Inoltre, un numero crescente di rapporti suggeriscono che gli oligodendrociti interagiscono con neuroni oltre la mielinazione, in particolare attraverso la secrezione di fattori solubili. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che consente la purificazione delle cellule di lignaggio oligodolole da colture cellulari gliali contenenti anche astrociti e cellule microgliali. Il metodo si basa sull'agitazione notturna a 37 gradi centigradi, che consente il distacco selettivo delle cellule oliedendrogliali sovrastanti e delle cellule microgliali e l'eliminazione della microglia mediante adesione differenziale. Descriviamo quindi la cultura degli oligodendrociti e la produzione di mezzi condizionati con oligodendrociti (OCM). Forniamo anche la cinetica del trattamento OCM o oligodendrociti aggiunta ai neuroni ippocampali purificati in esperimenti di co-cultura, studiando le interazioni oligodendrocite-neurone.
Introduzione
Gli oligodendrociti (OL) sono cellule gliali del sistema nervoso centrale (SNC) che generano mielina avvolgendo gli assoni. Gli OL provengono da cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) che proliferano all'interno delle zone ventricolari del SNC embrionale e poi migrano e si differenziano in OL completamente maturi (cioè cellule formanti mielina)1. Gli OPC sono abbondanti durante lo sviluppo precoce, ma persistono anche nel cervello adulto dove rappresentano la principale popolazione di cellule proliferanti2. Un singolo OL racchiude più assoni multipli in sezioni non eccitabili (ad esempio, internodi) e il bordo di....
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Protocollo
La cura e l'uso dei ratti in questo esperimento sono conformi alle politiche e agli orientamenti istituzionali (UPMC, INSERM e alla direttiva 86/609/CEE del Consiglio della Comunità europea). Il seguente protocollo è stabilito per una lettiera standard di 12 cuccioli.
1. Preparazione dei flaconi (5 min)
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi il giorno prima della dissezione in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Rivestire i flaconi 150 cm2 (T150) con tappo filtrante (1 flacone per 2 cuccioli) utilizzando 5 mL di polietilenimina (PEI, 100 mg/L, vedere protocollo nel file sup....
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Risultati
In questo protocollo, le cellule di lignaggio OL vengono purificate dalle colture gliali scrollandosi di dosso gli astrociti e microglia. La purezza e l'esame fenotipica delle colture OL possono essere valutati immunostaining con marcatori gliali15. L'analisi dell'espressione di diversi marcatori ha indicato che le colture OL erano per lo più pre-OL con il 90% diO4 - cellule, 85% - 7% NG2, cellule, e 4.7% - 2,1% di PLP- cellule, men.......
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Discussione
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per ottenere impostazioni cellulari l'oligodendrogliale altamente arricchite da colture gliali miste, adattate da un metodo pubblicato in precedenza16,e la successiva produzione di mezzo condizionato da OL. Questa tecnica di agitazione non è costosa, può essere ripetuta tre volte ed è ottimale per ottenere un'elevata quantità di OL purificati, come le cellule coltivate in Bottenstein-Sato (BS) proliferano PDGF. Le cellule gliali sono preparate utilizzando co.......
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Dichiarazioni
Nessuno degli autori ha interessi contraddittori o interessi contrastanti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Rémi Ronzano per i suoi saggi consigli nel montaggio di manoscritti. Questo lavoro è stato finanziato da ICM, INSERM, sovvenzione della fondazione ARSEP per NSF e Bouvet-Labruyère price.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Integratore di 5-fluorodesossiuridina | Sigma | F0503 | |
| B27 | ThermoFisher | 17504044 | |
| Soluzione di D-(+)-glucosio | Sigma | G8769 | |
| DNasi (desossiribonucleasi I) | Worthington | LS002139 | |
| Eagle modificato di Dulbecco Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| etanolo 100% | Sigma | 32221-M | |
| Etanolo 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Siero fetale di vitello | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cisteina | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papaina | Worthington | LS003126 | |
| Penicillina-Streptomicina | ThermoFisher | 15140122 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polietilenimmina (PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborato decaidrato | Sigma | B9876 | |
| Tripsina | Sigma | Sigma | |
| Uridina | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin umano | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulina | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillina-Streptomicina | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescina dicloridrato | Sigma | P5780 | |
| Selenito di sodio | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodico) | Sigma | T6397 | |
| T4 ( L-tiroxina) | Sigma | T1775 | |
| Terreni di co-coltura | |||
| apo-transferrina umana | Sigma | T1147 | |
| B27 integratore | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotina | Sigma | B4639 | |
| BSA (Albumina sierica bovina) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmina | Sigma | 239799 | |
| Eagle modificato di Dulbecco Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Idrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulina | Sigma | I5500 | |
| N-acetil-L-cisteina | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillina-Streptomicina | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| CNTF umano ricombinante | Sigma | 450-13 | |
| Selenito di sodio | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodico) | Sigma | T6397 | |
| Vitamina B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µ m filtro | Sartorius | 514-7010 | |
| siringa da 1 ml | Terumo | 1611127 | |
| Piastra di Petri da 100 mm | Dutscher | 193100 | |
| Tubo da 15 ml | Corning Life Science | 734-1867 | |
| Tubo da 50 ml | Corning Life Science | 734-1869 | |
| Piastra di Petri da 60 mm | Dutscher | 067003 | |
| 70 micro; m filtro | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Microscopio binoculare | Olympus | SZX7 | |
| Pinze curve | Strumenti per le scienze | 11152-10 | |
| Pinze per le scienze fini | Strumenti per le scienze | 91150-20 | |
| Forbici chirurgiche grandi | Strumenti per le scienze | 14008-14 | |
| Bisturi | Swann-morton | 233-5528 | |
| Agitatore | Infors HT | ||
| Piccole forbici chirurgiche | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Cucchiaio chirurgico piccolo | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 pallone con tappo filtrante | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
Riferimenti
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Broph....
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Ristampe e permessi
