Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine d’Arabidopsis thaliana à une échelle spécifique au type cellulaire

Summary

La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) offre la possibilité de disséquer les programmes de développement avec un traitement minimal des organes et des tissus. Le protocole donne de l’ARN de haute qualité à partir de cellules ciblées avec un sous-unité ribosomal étiquetée protéine fluorescente verte (GFP). Les outils d’analyse en aval, tels que qRT-PCR ou ARN-seq, révèlent des profils d’expression spécifiques aux tissus et aux cellules.

Abstract

Dans cet article, nous donnons des instructions pratiques pour obtenir des données de traduction de différents types de cellules racinaires Arabidopsis thaliana par l’intermédiaire de la méthode de purification de l’affinité ribosome de traduction (TRAP) et de la préparation continue optimisée de bibliothèque à faible entrée.

En tant que matériau de départ, nous employons des lignées végétales qui expriment la protéine ribosomalE IFFOmalE RPL18 marquée par GFP d’une manière spécifique au type cellulaire par l’utilisation de promoteurs adéquats. Avant l’immunopurification et l’extraction d’ARN, le tissu est gelé, qui préserve l’intégrité des tissus et permet simultanément l’exécution d’études de série temporelle avec une résolution temporelle élevée. Notamment, les structures de mur cellulaire restent intactes, ce qui est un inconvénient majeur dans les procédures alternatives telles que les approches à base de tri cellulaire activée par fluorescence qui reposent sur le protoplasting tissulaire pour isoler les populations cellulaires distinctes. En outre, aucune fixation tissulaire n’est nécessaire comme dans les techniques basées sur la microdissection de capture laser, ce qui permet d’obtenir de l’ARN de haute qualité.

Cependant, l’échantillonnage des sous-populations de cellules et l’arn polysome-associé qui isolent limitent sévèrement les rendements d’ARN. Il est donc nécessaire d’appliquer des méthodes de préparation de bibliothèque suffisamment sensibles pour l’acquisition réussie de données par RNA-seq.

TRAP offre un outil idéal pour la recherche sur les plantes, car de nombreux processus de développement impliquent des voies de signalisation liées aux parois cellulaires et mécaniques. L’utilisation de promoteurs pour cibler des populations cellulaires spécifiques fait le pont entre le niveau d’organe et le niveau unicellulaire qui, à son tour, souffre de peu de résolution ou de coûts très élevés. Ici, nous appliquons TRAP pour étudier la communication cellule-cellule dans la formation latérale de racine.

Introduction

Poussé par l’application croissante des techniques de séquençage de nouvelle génération, la résolution spatiale en biologie du développement pourrait être augmentée. Les études contemporaines visent à disséquer les tissus vers le bas pour les types de cellules spécialisées, si ce n’est le niveau unicellulaire^1,2,3,4. À cette fin, une pléthore de différentes méthodes a été conçue au cours des cinquante dernières années (voir figure 1A)^{5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}.

De nombreux outils en science végétale ont été des adaptations de techniques qui ont été pionnières dans la recherche animale. Ce n’est pas le cas pour la méthode que nous introduisons en détail ici. En 2005, doté d’un solide fond de traduction de protéines, le Laboratoire Bailey-Serres a entrepris de concevoir des protéines ribosomales pour la purification ultérieure de l’affinité¹⁶. Ainsi, ils pourraient éviter le profilage polysome long et laborieux, qui est basé sur l’ultracentrifugation avec un gradient de saccharose et a été employé pour évaluer la traduction des ribosomes depuis les années 1960^17,18. La méthode a depuis été appelée purification d’affinité ribosome translationnelle (TRAP)¹⁶. Après des études réussies de traduction dans les plantes, Heiman et autres ont adapté TRAP pour les animaux¹⁹ et d’autres ont étendu son application à la levure²⁰, Drosophila²¹, Xenopus²² et le poisson zèbre^23,24.

Bien que la modification génétique du système modèle soit une condition préalable pour TRAP, qui limite son application aux espèces qui se prêtent à la transformation génétique, on peut simultanément exploiter cette objection pour cibler des sous-ensembles de cellules qui sont d’intérêt particulier et autrement extrêmement difficiles à isoler du tissu intact/organe²⁵ (p. ex., les cellules dendritiques fortement ramifiées dans un cerveau de souris ou hyphes fongiques dans le tissu végétal infecté). Dans les plantes, toutes les cellules sont maintenues en place par des parois cellulaires qui forment la base du squelette hydrostatique²⁶. Pour libérer une cellule végétale de cette matrice, les scientifiques ont soit physiquement coupé la cellule de son tissu environnant par microdissection de capture laser (LCM)²⁷ ou effectué la digestion enzymatique des parois cellulaires²⁸. Parmi ces dernières cellules, ce que l’on appelle les protoplastes, la population d’intérêt est étiquetée fluorescentement et peut être séparée par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)⁷. LCM nécessite généralement un échantillon à fixer et intégré dans la cire, ce qui finit par détériorer la qualité de son ARN²⁹. Les méthodes à base de FACS produisent de l’ARN de haute qualité, mais le processus de protoplasting lui-même introduit des différences dans l’expression^{génique 30} et les tissus avec des parois cellulaires secondaires modifiées et épaisses sont notoirement difficiles à traiter. En outre, de nombreux processus de développement dans les plantes sont supposés s’appuyer sur des signaux mécaniquement transmis et donc l’intégrité de la paroi cellulaire est d’une importance primordiale³¹. Deux méthodes, qui utilisent un raccourci pour contourner l’isolement cellulaire en opérant au niveau des nucléii, sont le tri nucléaire activé par la fluorescence (FANS) et l’isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT). Comme dans TRAP, ils utilisent des promoteurs spécifiques au type de cellule pour marquer les noyaux, qui se sont ensuite enrichis par tri ou tirer vers le bas, respectivement^8,15. Un défi majeur pour toutes ces approches est d’obtenir suffisamment de matériel d’ARN à partir de sous-ensembles de cellules dans un tissu. Comme TRAP ne capture qu’une fraction des ARN cellulaires, la collecte d’échantillons est un goulot d’étranglement considérable. Par conséquent, des protocoles de préparation de bibliothèque particulièrement sensibles sont nécessaires pour produire des données de haute qualité à partir de faibles quantités d’entrée.

Depuis sa création, TRAP a été utilisé en combinaison avec des microrésions d’ADN ou, comme les coûts de séquençage ont chuté de manière significative ces dernières années, RNA-seq^10,32,33. Une multitude de questions de recherche a déjà été élucidée tel qu’il a été examiné dans Sablok et coll.³⁴. Nous sommes convaincus que d’autres rapports suivront dans les années à venir, car la technique est très polyvalente lorsqu’elle combine différents promoteurs pour cibler des types de cellules spécifiques. Finalement, cela se fera même d’une manière inductible, et peut être combiné avec sonder la réaction de la plante à de nombreux facteurs de stress biotiques et abiotiques. En outre, lorsque des lignées transgéniques stables ne sont pas disponibles, les systèmes d’expression des racines poilues ont également été utilisés avec succès pour effectuer TRAP dans la tomate et medicago^35,36.

Figure 1 : La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) complète le portefeuille d’analyse « omics ». R. L’augmentation des niveaux de précision analytique, jusqu’à la résolution unicellulaire ou même subcellulaire peut être obtenue par une pléthore de méthodes ou de combinaisons de celui-ci. Le programme donne un aperçu des outils actuellement disponibles dans le domaine des plantes et des animaux. La collecte de tissus à la résolution cellulaire peut être obtenue par des protocoles comme LCM ou FACS, qui sont ensuite couplés à un transcriptome standard ou à une analyse de profilage/traduction polysome. TRAP et INTACT intègrent à la fois la capture des tissus et l’isolement de l’ARN car ils sont basés sur l’épitope-marquage. Cependant, INTACT n’échantillonne que les noyaux cellulaires et constitue, par conséquent, un cas particulier d’analyse de transcriptome. Une petite icône de lapin marque des méthodes nouvellement développées dans le domaine animal : Alors que SLAM-ITseq et Flura-seq s’appuient sur la ciblage métabolique des ARN naissants avec des bases d’uracil modifiées dans les cellules exprimant l’enzyme permissive, Slide-seq utilise une diapositive en verre enduit avec des codes-barres d’ADN qui fournissent des informations de position dans la gamme cellulaire. Une approche d’étiquetage de proximité est suivie dans APEX-seq pour échantillonner les ARN dans des compartiments subcellulaires spécifiques. Notamment, une résolution accrue nécessite souvent la production de matériaux transgéniques (astérisques) et ces méthodes sont donc principalement utilisées pour les espèces modèles. TRAP est particulièrement adapté pour les études scientifiques végétales impliquant la paroi cellulaire (CW) ou la signalisation mécanique ainsi que les espèces cellulaires qui sont difficiles à libérer de leur matrice CW. B. Les étapes détaillées de la procédure TRAP : Les semis exprimant des protéines ribosomal étiquetées GFP dans des types cellulaires distincts (p. ex. endodermis de racine) sont cultivés sur des plats Petri pendant sept jours et des racines récoltées par congélation rapide. Un échantillon total de contrôle de l’ARN est prélevé sur l’extrait brut homogénéisé avant de pelleter les débris par centrifugation. Des perles magnétiques anti-GFP sont ajoutées à l’extrait effacé pour effectuer l’immunoprécipitation. Après l’incubation et trois étapes de lavage, l’ARN polysome-associé (TRAP/ARN polysome) est directement obtenu par extraction de phénol-chloroforme. LCM : microdissection de capture laser, FACS/FANS : tri cellulaire/nucléaire activé par fluorescence, APEX-seq: méthode basée sur l’ascorbate peroxidase, INTACT: isolation des noyaux étiquetés dans des types cellulaires spécifiques, SLAM-ITseq: thiol (SH) alkylation liée à la séquence métabolique de l’ARN dans les tissus, Flura-seq: fluorouracil-étiqueté RNA séquençage (Créé avec Biorender.com) S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Le but de cet article est de fournir une description détaillée de la méthode TRAP, de mettre en évidence les étapes critiques et de fournir des conseils pour une méthode de préparation possible de la bibliothèque.

Une expérience TRAP générique consistera essentiellement en les étapes suivantes (voir aussi la figure 1B) : (1) Préparation du matériel végétal, y compris le clonage de la construction de ribosome-marquage, la production et la sélection transgéniques de lignées, la culture et l’encombrement des graines, la stérilisation et le placage, et l’application/traitement du stress (facultatif) et la récolte des tissus; (2) l’immunopurification, y compris l’homogénéisation des tissus et le dégagement de l’extrait brut, le lavage et l’immunopurification des perles, et les étapes de lavage; (3) Évaluation de la qualité de l’ARN; et (4) la préparation de la bibliothèque.

La racine Arabidopsis a été un système modèle pour étudier le développement des plantes depuis son introduction comme une plante modèle^37,38. Ici, l’application de TRAP est présentée dans le contexte du développement latéral des racines végétales. Dans les plantes, l’accumulation de l’ensemble du système racinaire repose sur l’exécution de ce programme et est donc très importante pour la survie de l’organisme³⁹. Dans Arabidopsis, les racines latérales proviennent de tissu péricycle qui réside à côté des vaisseaux xylèmes et est donc appelé pericycle pôle xylème (XPP; voir figure 2C)⁴⁰. Certaines cellules XPP, qui sont situées profondément à l’intérieur de la racine, acquièrent une identité cellulaire fondatrice et, sur un déclencheur hormonal local, commencent à proliférer en gonfleant et en divisant anticlinally⁴¹. Cependant, en raison de la présence d’une matrice rigide de mur cellulaire, ce processus exerce le stress mécanique sur les tissus environnants. En particulier, l’endoderme overlying est affecté, car il est dans la voie de l’axe de croissance latérale des racines^42,43,44. En effet, le primordium nouvellement formé devra se développer à travers la cellule endodermis overlying (figure 2C2) tandis que les cellules cortex et épiderme sont juste repoussées pour que le primordium émerge enfin^45,46. Des travaux récents dans notre laboratoire ont montré que l’endoderme contribue activement à la prolifération du péricycle. Le blocage ciblé de la signalisation hormonale endodermique est suffisant pour inhiber même la toute première division dans les cellules XPP⁴⁷. Par conséquent, la communication péricycle-endodermis constitue un point de contrôle très précoce pour le développement latéral des racines dans Arabidopsis. On ne sait cependant pas comment cette traque est effectuée. Pour percer ce mystère, nous avons choisi l’approche TRAP-seq pour cibler XPP et les cellules endodermiques. Pour enrichir pour les cellules dans le programme de racine latérale, nous avons imité le déclencheur hormonal en appliquant exogènement un analogue auxin (acide à laphthalèneacécéétique, NAA)⁴⁸, qui en même temps a permis de résoudre temporellement la phase initiale de la formation latérale de racine.

Protocol

1. Clonage de la production et de la sélection transgéniques transgéniques Clonez le promoteur de choix dans le vecteur d’entrée approprié. Utilisez une méthode de clonage à base de recombinaison(Tableau des matériaux) et recombiner les promoteurs dans pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (avec étiquette d’affinité ou protéine fluorescente de choix) en utilisant le clonage à base de recombinaison dans pDONRP1-P249. Combinez le vecteur d’entrée contenant …

Representative Results

Pour l’évaluation de la qualité, la procédure susmentionné devrait être examinée à plusieurs étapes intermédiaires : validation du modèle d’expression dans planta, contrôle de la qualité de l’ARN polysomique isolé ainsi que des bibliothèques finales. qRT-PCR utilisant des gènes marqueurs connus peuvent, en outre, être exécutés pour confirmer la réponse à l’état de traitement ou pour affiner les conditions expérimentales. <p class="jove_content" fo:keep-to…

Discussion

Vérification du modèle de localisation RPL18
Crucial pour éviter une mauvaise interprétation des données de toute expérience TRAP est le modèle d’expression approprié du sous-unité ribosomal marqué. Par conséquent, l’incorporation de GFP comme une étiquette d’épitope à RPL18 permet très élégamment la vérification du modèle d’expression désiré et consécutivement, retirer la fraction polysome du même tissu. Des approches plus invasives pour assurer des modèles de promoteu…

Materials

Sterilization
bleach, 13%	Sigma	71696
beaker	VWR	214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN)	Sigma/Merck	Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a.	Honeywell	02860-1L
HCl, 37%	Roth	4625.1
Tween 20	Sigma	P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer	Duchefa	M0254
agar plant for cell culture	Applichem/Panreac	A2111.1000
DMSO	Sigma	D4540
forcepts	Rubis Switzerland	5-SA model
KOH	Fluka	60370
micropore/surgical tape	3M	1530-0
NAA	Duchefa	N0903
petri dishes 120×120 mm	Greiner bio-one	688102
scalpel	VWR/Swann-Morton	233-5454
tissues, neutral, two-layered			any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA	Chromotek	e.g. gtma-100
Brij-35	Sigma	P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)	Beckman Coulter	357001
Chloramphenicol	Applichem	C0378-25G
cotton gloves	VWR	113-7355
Cycloheximide, HPLC grade	Sigma	01810-1G
DEPC	VWR	E174	might have long delivery times
DTT	Fluka	43815
EGTA	Sigma	3054.3
homogenizers DUALL 23	KONTES GLASS CO (via VWR)	SCERSP885450-0023 (set)	SCERSP885451-0023 pestle only – SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360	Sigma	I3021-100ml
KCl	Sigma	60130
MgCl2 hexahydrat	Roth	2189.2
mortar and pestle	VWR	470148-960 & 470019-978
PMSF	Roche	10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE	Sigma	P2393-500G
RNase-free water	Roth	T143.3
RNAZap	Thermo Fisher	AM9780/AM9782	for cleaning surfaces
Tris, >99.3%	Roth	AE15.3
Triton X-100	Fluka	T8787-250ml
Tween 20	Sigma	P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a.	Sigma	33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade	Scharlau	CL02181000
EtOH, p.a.	Honeywell	02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml	Eppendorf/Sigma	Z666548-250EA	LoBind
RNase-free DNase set	Qiagen	79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit	Qiagen	74204
TRIzol reagent	ThermoFisher/Ambion	15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator	Abraxis	PN 472250
AMPure beads	Beckman Coulter	A63881
Index Kit A	Illumina	FC-131-2001
Index Kit D	Illumina	FC-131-2004
neodymium magnets	Amazon/other	6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit	Illumina	FC-131-1024/1096	https://emea.support.illumina.com/
PCR strips	ThermoScientific	AB-0266
SMARTer v4 kit	Takara Bioscience	634892	https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer	Agilent	2100 Bioanalyzer Instrument	specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation	Agilent	4200 Tapestation Instrument	specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer	Agilent	5400 Fragment Analyzer System	specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip	PerkinElmer	LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer	specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer	ThermoFisher	Q33239	specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23	Microsynth		fwd: AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG; rev: GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC
GH3.3	Microsynth		fwd: CAAACCAATCCT CCAAATGAC; rev: ACTTATCCGCAA CCCGACT
LBD29	Microsynth		fwd: TCTCCAACAACA GGTTGTGAAT; rev: AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA
UBC21	Microsynth		fwd: TGCGACTCAGGG AATCTTCT; rev: TCATCCTTTCTT AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green	Bio-Rad	#172-5270
iScript Adv cDNA Kit	Bio-Rad	#172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar	Greiner bio-one	188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar	Greiner bio-one	210261
filter tips 1 ml	Axygen	TF-1000-R-S
filter tips 10 µl	Axygen	TF-10-R-S
filter tips 100 µl	Axygen	TF-100-R-S
filter tips 20 µl	Axygen	TF-20-R-S
filter tips 200 µl	Axygen	TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml	SARSTEDT	72.690.001
Propidium iodide	Sigma	P4170-100MG
sequencing company	Novogene		en.novogene.com