Generasjon av en human iPSC-basert blod-brain barriere chip

Summary

Blod-hjernebarrieren (BBB) er en flercellet nevrovaskulær enhet som regulerer hjernens homeostase tett. Ved å kombinere menneskelige iPSCer og organ-on-chip-teknologier, har vi generert en personlig BBB-chip, egnet for sykdomsmodellering og CNS-prognoser for legemiddelpenetrabilitet. En detaljert protokoll er beskrevet for generering og drift av BBB-chipen.

Abstract

Blodhjernebarrieren (BBB) dannes av nevrovaskulære enheter (NVUer) som beskytter sentralnervesystemet (CNS) fra en rekke faktorer som finnes i blodet som kan forstyrre delikat hjernefunksjon. Som sådan er BBB et stort hinder for levering av terapeutiske midler til CNS. Akkumulerende bevis tyder på at BBB spiller en nøkkelrolle i utbruddet og progresjonen av nevrologiske sykdommer. Dermed er det et enormt behov for en BBB-modell som kan forutsi penetrasjon av CNS-målrettede legemidler, samt belyse BBBs rolle i helse og sykdom.

Vi har nylig kombinert organ-on-chip og indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologier for å generere en BBB chip fullt personlig til mennesker. Denne nye plattformen viser cellulære, molekylære og fysiologiske egenskaper som er egnet for prediksjon av narkotika- og molekyltransport over hele den menneskelige BBB. Videre, ved hjelp av pasientspesifikke BBB-chips, har vi generert modeller av nevrologisk sykdom og demonstrert potensialet for personlige prediktive medisinapplikasjoner. Gitt her er en detaljert protokoll som viser hvordan å generere iPSC-avledede BBB chips, som begynner med differensiering av iPSC-avledet hjerne mikrovaskulære endotelceller (iBMECs) og resulterer i blandede nevrale kulturer som inneholder nevrale forfedre, differensierte nevroner og astrocytter. Også beskrevet er en prosedyre for seeding celler i orgelchip og kuling av BBB chips under kontrollert lamimer flyt. Til slutt er detaljerte beskrivelser av BBB-chipanalyser gitt, inkludert paracellulær permeabilitetsanalyser for vurdering av legemiddel og molekylpermeabilitet samt immuncytokjemiske metoder for å bestemme sammensetningen av celletyper i brikken.

Introduction

BBB er en svært selektiv barriere som skiller CNS fra det sirkulerende blodet. Det beskytter kritiske hjernefunksjoner mot potensielt forstyrrende stoffer, faktorer og xenobiotika samtidig som tilstrømningen av næringsstoffer og andre metabolitter som kreves for å opprettholde hjernens homeostase¹. BBB er en flercellet NVU der pericytes, astrocyttende endeføtter og nevronale prosesser direkte kontakter hjernens mikrovaskulære endotelceller (BMECer). Disse interaksjonene tillater BMECs å danne spesialiserte barriereegenskaper som støttes av stramme og overholder veikryss^2,3. Dannelsen av denne barrieren begrenser paracellulær passasje av molekyler, men den inneholder polariserte transportører for å aktivt transportere molekyler inn i CNS eller tilbake i blodet¹. På grunn av disse unike barriereegenskapene utgjør BBB et stort hinder for levering av biofarmasi i hjernen, og det er anslått at mindre enn 5% av FDA-godkjente små molekyler kan nå CNS⁴.

Dyremodeller har blitt mye brukt til å studere BBB-penetans og de molekylære mekanismene som er involvert i BBB-utvikling⁵. Mens dyremodeller trofast representerer det komplekse flercellulære in vivo-miljøet, utelukker forskjeller i uttrykk og aktivitet av BBB-transportører samt substratspesifisitet på tvers av arter ofte nøyaktig ekstrapolering av dyredata til mennesker⁶. Dermed er menneskebaserte modeller avgjørende for å studere den menneskelige BBB og for bruk i utviklingen av legemidler designet for å målrette CNS. Dette behovet blir enda tydeligere med den økende dominansen av biologiske, menneskespesifikke legemidler i det farmasøytiske utviklingsfeltet. Akkumulerende bevis tyder på at en kompromittert BBB er forbundet med en rekke alvorlige CNS lidelser, inkludert hjernesvulster og nevrologiske sykdommer^7,8,9. Menneskelige modeller som trofast reflekterer disse sykdommene har potensial til både 1) identifisere nye veier som kan målrettes for narkotikautvikling og 2) forutsi CNS penetan, og dermed redusere tid og ressurser i prekliniske studier og muligens redusere svikt i kliniske studier.

In vitro-modeller har blitt mye implementert for å studere interaksjoner mellom BMECs og andre celler i NVU og gjennomføre skjermer for potensielle BBB-permeable legemidler¹⁰. For å gjenskape viktige aspekter ved den menneskelige BBB, må in vitro-modellene vise fysiologisk relevante egenskaper (dvs. lav paracellulær permeabilitet og fysiologisk relevant transendothelial elektrisk motstand [TEER] på tvers av den endoteliske monolayer). I tillegg må den molekylære profilen til et in vitro-system inkludere uttrykk for representative funksjonelle transportsystemer. Vanligvis består in vitro-modeller av endotelceller som er co-cultured på en semipermeable membran med kombinasjoner av andre NVU-celler for å forbedre BBB egenskaper¹¹. Denne tilnærmingen gir enkel og relativt rask vurdering av barrierefunksjonalitet og molekylgjennomtrengelighet. Slike cellebaserte BBB-modeller kan etableres med dyre- eller menneskecellekilder, inkludert celler isolert fra kirurgiske eksisjoner eller udødelige BMEC-linjer.

Nylig ble protokoller for å differensiere menneskelige pluripotente celler i BMECer introdusert som en attraktiv kilde for in vitro menneskelige BBB-modeller^12,13. Indusert pluripotent stamcelle (iPSC)-avledede BMECs (iBMECs) er svært skalerbare, viser avgjørende morfologiske og funksjonelle egenskaper ved den menneskelige BBB, og bærer genetikken til pasienten. I kulturen danner iBMECs et monolayer som uttrykker stramme koblingsmarkører og viser i vivo-lignende tette koblingskomplekser. Disse cellene uttrykker også BBB-markører, inkludert BBB glukosetransportør, glukosetransportør 1 (GLUT1). Viktigere, og i motsetning til andre alternative cellekilder for menneskelige BMECer, iBMECs skaffe barriere egenskaper med verdier så høyt som de målt in vivo¹⁴, polarisere langs basolateral eakse, og uttrykke funksjonelle efflux pumper. Videre ønsker bruk av iPSCer fra ulike begge 1) muligheten til å teste aspekter av BBB på en personlig medisin måte og 2) gir en fleksibel kilde for å generere flere celletyper av NVU. Generere disse cellene fra en isogen cellekilde for å lage personlige BBB chips ville også hjelpe i å forstå mellom individuelle forskjeller i narkotikaresponser, som er en viktig årsak til motstand eller kompromittert respons på behandling observert i kliniske studier.

Bruk av iBMECs som monolayers i en tallerken eller på en semi gjennomtrengelig transwell innsats representerer en kraftig tilnærming for BBB modellering. Disse systemene har en tendens til å være robuste, reproduserbare og kostnadseffektive. I tillegg er funksjonelle analyser som TEER og permeabilitet relativt enkle å utføre. Todimensjonale (2D) systemer klarer imidlertid ikke å rekapitulere 3D-naturen til in vivo-vev, og de mangler de fysiologiske skjærstresskreftene som tilbys av sirkulerende blod og blodceller. Dette begrenser evnen til vaskulær endotel i disse modellene for å utvikle og opprettholde iboende BBB egenskaper og funksjoner.

Mikrokonstruerte systemer foret av levende celler har blitt implementert for å modellere ulike organfunksjoner i et konsept som kalles organ-on-chips. Ved å gjenskape in vivo-lignende flercellet arkitektur, vevsgrensesnitt, fysikokjemiske mikromiljøer og vaskulær perfusjon, genererer disse mikrokonstruerte plattformene nivåer av vev og organfunksjonalitet som ikke er mulig med konvensjonelle 2D kultursystemer. De muliggjør også høyoppløselig, sanntidsavbildning og analyse av biokjemiske, genetiske og metabolske profiler som ligner på levende celler i in vivo vev og organkontekst. En spesiell utfordring av organ-on-chip er imidlertid at design, fabrikasjon og anvendelse av disse mikrokonstruerte chips krever spesialisert ingeniørkompetanse som vanligvis mangler i biologisk orienterte akademiske laboratorier.

Vi har nylig kombinert iPSC og organ-on-chip teknologier for å generere en personlig BBB chip modell^15,16. For å overvinne de teknologiske utfordringene som er beskrevet, brukes den kommersielt tilgjengelige Chip-S1 sammen med kulturmodulen, et instrument designet for å automatisere vedlikeholdet av sjetongene på en enkel og robust måte (Emuler Inc.). BBB-brikken gjenskaper interaksjoner mellom nevrale og endotelceller og oppnår fysiologisk relevante TEER-verdier, som måles ved skreddersydde organbrikker med integrerte gullelektroder¹⁷. I tillegg viser BBB-brikken lav paracellulær permeabilitet, reagerer på inflammatoriske signaler på orgelnivå, uttrykker aktive efflux pumper, og viser prediktiv transport av løselige biomarkører og biofarmasi. Spesielt fanger BBB-chips generert fra flere personer de forventede funksjonelle forskjellene mellom friske individer og pasienter med nevrologiske sykdommer¹⁵.

Protokollen som er beskrevet nedenfor beskriver en pålitelig, effektiv og reproduserbar metode for generering av humane iPSC-baserte BBB-brikker under dynamiske strømningsforhold. Veiledning gis om typen analyser og endepunktsanalyser som kan utføres direkte i BBB-chipen eller fra prøvetaking av avløpsvann. Dermed demonstrerer protokollen spekteret av teknikker som kan brukes for evaluering av biologiske og funksjonelle egenskaper og svar i en menneskelig relevant modell.

En kort beskrivelse av iPSC-baserte BBB-chip er gitt her. Menneskelige iPSCer er i utgangspunktet differensiert og forplantes i vevkulturflasker som frittflytende aggregater av nevrale forfedre, kalt EZ-sfærer. Den øverste kanalen av Chip-S1^16,18,19 er seeded med dissosierte EZ-kuler som danner “hjernen side” av chip, som celler skiller over 7 dager inn i en blandet kultur av nevrale stamceller (iNPCer), iAstrocytes, og iNeurons. Menneskelige iPSCer er også differensiert i vevkulturplater til iBMECs. Den nederste kanalen av brikken er seeded med iBMECs å danne “blod siden” som de utvikler seg for å danne en endotelrør (Figur 1). Den porøse ekstracellulære matrisen (ECM)-belagt membran som skiller topp- og bunnkanalene 1) tillater dannelsen av celle-til-celle-interaksjoner mellom kanaler og 2) gjør det mulig for brukeren å kjøre permeabilitetsanalyser og bildeceller i begge kanalene ved hjelp av et konvensjonelt lysmikroskop.

Protocol

1. Generasjon av iPSC-avledede nevrale stamceller (iNPCer) Produser EZ-kuler fra iPSC kolonier som beskrevet nedenfor og som tidligere publisert20,21,22. Kultur iPSC kolonier for å samtidigpåvirke kjellermembran matrisebelagte 6 brønnplater (0,5 mg/plate) i mTESR1 eller andre kommersielle medier (se Materialtabell). Fjern iPSC medium og erstatt med 2 ml EZ-sfæremedium [ESM; DMEM:…

Representative Results

Figur 6A,B,C representerer en BBB chip seeded med EZ-kuler på “hjernesiden” toppkanal og iBMECs på “blodsiden”” bunnkanal. iBMECs ble seeded først og lov til å feste over natten, hvoretter EZ-sfærer ble seeded. Chips ble deretter kultivert under statiske forhold med daglig medieerstatning i syv dager. BBB-brikken ble deretter fikset ved hjelp av 4% PFA ved RT i 10 min og vasket 3x med DPBS. Immuncytokjemi ble utført på BBB-chipen ved hjelp av 1) nestin som markør for…

Discussion

Kombinasjonen av organ-on-chip-teknologi og iPSC-avledede celler i NVU holder løfte om nøyaktig modellering av det menneskelige BBB. Her gir vi en detaljert protokoll for enkel og robust anvendelse av den nylig publiserte iPSC-baserte BBB-chip¹⁶. En oversikt og tidspunkt for frøing paradigme er vist i figur 3. For å oppnå og vedlikeholde barrierefunksjoner som er egnet for BBB-modellering, er det avgjørende å generere en homogen iBMEC monolayer og beholde integ…

Materials

Accutase	EMD Millipore	SCR005	Dissociation solution
B27	Gibco	12587010
Bfgf	Peprotech	100-18B
Chip-S1	Emulate Inc	Chip-S1	Organ-Chip
Collagen IV	Sigma	C5533
DAPI	Invitrogen	D3571
Dextran-FITC	Sigma	46944
DMEM: F12	Thermo Fisher Scientific	31330038
Donkey serum	Sigma	D9663
Emulate Reagent 1 (ER-1)	Emulate Inc	ER-1
Emulate Reagent 2 (ER-2)	Emulate Inc	ER-2
Fibronectin	Sigma	F1141
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako	Z0334
GLUT-1	Invitrogen	MA5-11315
Glutamax	Life Technologies	35050038	Glutamine supplement
hBDNF	Peprotech	450-02
KOSR	Thermo Fisher Scientific	10828028
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	354234	Basement membrane matrix
mTeSR1	StemCell Technologies, Inc.	85851
NEAA	Biological industries	01-340-1B
Nestin	Millipore	MAB353
NutriStem	Biological industries	05-100-1A	Alternate media
PECAM-1	Thermo Fisher Scientific	10333
Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)	Biomedical Technologies	J64483AB
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625
S100β	Abcam	ab6602
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SCGP00525
Triton X-100	Sigma	X100
ZO-1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	33-9100
βIII-tubulin (Tuj1α)	Sigma	T8660
β-mercaptoethanol	Life Technologies	31350010