Generazione di un chip di barriera emato-encefalica basata sull'iPSC umano

Summary

La barriera emato-encefalica (BBB) è un’unità neurovascolare multicellulare che regola strettamente l’omeostasi cerebrale. Combinando gli iPSC umani e le tecnologie organ-on-chip, abbiamo generato un chip BBB personalizzato, adatto per la modellazione delle malattie e le previsioni di penetrazione dei farmaci del SNC. Viene descritto un protocollo dettagliato per la generazione e il funzionamento del chip BBB.

Abstract

La barriera ematoencefalica (BBB) è formata da unità neurovascolari (NKU) che proteggono il sistema nervoso centrale (SNC) da una serie di fattori presenti nel sangue che possono interrompere la delicata funzione cerebrale. Come tale, la BBB è un ostacolo importante per la fornitura di terapie al SNC. Sempre più prove suggeriscono che la BBB svolge un ruolo chiave nell’insorgenza e nella progressione delle malattie neurologiche. Pertanto, vi è un’enorme necessità di un modello BBB in grado di prevedere la penetrazione di farmaci mirati al SNC e di chiarire il ruolo della BBB nella salute e nella malattia.

Recentemente abbiamo combinato tecnologie di cellule staminali pluripotenti (iPSC) organo-su chip e cellule staminali pluripotenti indotte per generare un chip BBB completamente personalizzato per l’uomo. Questa nuova piattaforma mostra proprietà cellulari, molecolari e fisiologiche che sono adatte per la previsione del trasporto di farmaci e molecole attraverso il BBB umano. Inoltre, utilizzando chip BBB specifici per il paziente, abbiamo generato modelli di malattia neurologica e dimostrato il potenziale per applicazioni di medicina predittiva personalizzata. Fornito qui è un protocollo dettagliato che dimostra come generare chip BBB derivati da iPSC, a partire dalla differenziazione delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali derivate da iPSC (iBMEC) e con conseguente colture neurali miste contenenti progenitori neurali, neuroni differenziati e astrociti. Viene inoltre descritta una procedura per la semina di cellule nel chip dell’organo e la coltura dei chip BBB sotto flusso laminare controllato. Infine, vengono fornite descrizioni dettagliate delle analisi dei chip BBB, compresi i saggi di permeabilità paracellulare per la valutazione della permeabilità di farmaci e molecole, nonché metodi immunocitochimici per determinare la composizione dei tipi di cellule all’interno del chip.

Introduction

Il BBB è una barriera altamente selettiva che separa il SNC dal sangue circolante. Protegge le funzioni cerebrali critiche da sostanze potenzialmente dirompenti, fattori, e xenobiotici, consentendo anche l’afflusso di sostanze nutritive e altri metaboliti necessari per mantenere l’omeostasi del cervello¹. Il BBB è un NVU multicellulare in cui periciti, piedi finali astrociti e processi neuronali contattano direttamente le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC). Queste interazioni consentono ai BMEC di formare proprietà di barriera specializzate supportate da giunzioni strette e aderente^2,3. La formazione di questa barriera limita il passaggio paracellulare delle molecole, ma contiene trasportatori polarizzati per trasportare attivamente le molecole nel SNC o di nuovo nel sangue¹. A causa di queste proprietà di barriera uniche, la BBB costituisce un grande ostacolo alla consegna di biofarmaceutici nel cervello, e si stima che meno del 5% delle piccole molecole approvate dalla FDA possa raggiungere il CNS⁴.

I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per studiare la penetrazione BBB e i meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo di BBB⁵. Mentre i modelli animali rappresentano fedelmente il complesso ambiente multicellulare in vivo, le differenze di espressione e di attività dei trasportatori BBB, nonché la specificità del substrato tra le specie spesso precludono un’accurata estrapolazione dei dati sugli animali agli esseri umani⁶. Pertanto, i modelli a base umana sono fondamentali per studiare la BBB umana e per l’uso nello sviluppo di farmaci progettati per indirizzare il SNC. Questa necessità diventa ancora più evidente con la crescente dominanza dei farmaci biologici, specifici per l’uomo nel campo dello sviluppo farmaceutico. Sempre più prove suggeriscono che una BBB compromessa è associata a una serie di gravi disturbi del SNC, tra cui tumori cerebrali e malattie neurologiche^7,8,9. I modelli umani che riflettono fedelmente queste malattie hanno il potenziale sia 1) identificare nuovi percorsi che potrebbero essere mirati per lo sviluppo di farmaci e 2) prevedere la penetrazione del SNC, riducendo così il tempo e le risorse negli studi preclinici e possibilmente diminuendo il tasso di fallimento negli studi clinici.

I modelli in vitro sono stati ampiamente implementati per studiare le interazioni tra BMEC e altre cellule della NVU e condurre schermi per potenziali farmaci permeabili BBB¹⁰. Per ricreare gli aspetti chiave della BBB umana, i modelli in vitro devono mostrare proprietà fisiologicamente rilevanti (cioè bassa permeabilità paracellulare e resistenza elettrica transetthelial fisiologica [TEER] attraverso il monostrato endoteliale). Inoltre, il profilo molecolare di un sistema in vitro deve includere l’espressione di sistemi di trasporto funzionali rappresentativi. Tipicamente, i modelli in vitro sono composti da cellule endoteliali co-coltivate su una membrana semipermeabile con combinazioni di altre cellule NVU per migliorare le proprietà BBB¹¹. Questo approccio consente una valutazione semplice e relativamente rapida della funzionalità della barriera e della permeabilità delle molecole. Tali modelli BBB a base cellulare possono essere stabiliti con fonti cellulari animali o umane, comprese le cellule isolate da escissioni chirurgiche o linee BMEC immortalate.

Recentemente, sono stati introdotti protocolli per differenziare le cellule pluripotenti umane in BMEC come fonte interessante per i modelli BBB umani in vitro^12,13. I BMEC derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono altamente scalabili, dimostrano le caratteristiche morfologiche e funzionali cruciali della BBB umana e portano la genetica del paziente. Nella coltura, gli iBMEC formano un monostrato che esprime marcatori di giunzione stretti e display in complessi di giunzione stretti simili a in vivo. Queste cellule esprimono anche marcatori BBB, tra cui il trasportatore di glucosio BBB, il trasportatore di glucosio 1 (GLUT1). È importante sottolineare che, e a differenza di altre fonti di cellule alternative per i BMEC umani, gli iBMETC acquisiscono proprietà di barriera con valori alti come quelli misurati in vivo¹⁴, polarizzano lungo l’asse basolaterale ed esprimono pompe efflux funzionali. Inoltre, l’uso di iPSC da vari soggetti sia 1) accoglie con favore l’opportunità di testare gli aspetti della BBB in modo medico personalizzato e 2) fornisce una fonte flessibile per la generazione di ulteriori tipi di cella della NVU. Generare queste cellule da una fonte di cellule isogeniche per creare chip BBB personalizzati aiuterebbe anche a comprendere le differenze inter individuali nelle risposte dei farmaci, che è una delle principali cause di resistenza o risposta compromessa al trattamento osservata negli studi clinici.

L’uso di iBMEC come monostrati in un piatto o su un inserto transwell semi permeabile rappresenta un approccio potente per la modellazione BBB. Questi sistemi tendono ad essere robusti, riproducibili ed economici. Inoltre, le analisi funzionali come TEER e la permeabilità sono relativamente semplici da eseguire. Tuttavia, i sistemi bidimensionali (2D) non riescono a ricapitolare la natura 3D del tessuto in vivo, e non hanno le forze fisiologiche di stress da taglio fornite dalle cellule del sangue e del sangue circolanti. Questo limita la capacità dell’endotelio vascolare in questi modelli di sviluppare e mantenere proprietà e funzioni BBB intrinseche.

I sistemi microingegneririvestiti allineati da cellule viventi sono stati implementati per modellare varie funzionalità degli organi in un concetto chiamato organ-on-chips. Ricreando l’architettura multicellulare in vivo, le interfacce dei tessuti, i microambienti fisiochimici e la perfusione vascolare, queste piattaforme microingegnerizzate generano livelli di funzionalità dei tessuti e degli organi non possibili con sistemi di coltura 2D convenzionali. Consentono inoltre l’alta risoluzione, l’imaging in tempo reale e l’analisi di profili biochimici, genetici e metabolici simili alle cellule viventi nel contesto del tessuto in vivo e dell’organo. Tuttavia, una sfida particolare dell’organo su chip è che la progettazione, la fabbricazione e l’applicazione di questi chip microingegnerizzati richiede competenze ingegneristiche specializzate che di solito mancano nei laboratori accademici biologicamente orientati.

Recentemente abbiamo combinato tecnologie iPSC e organ-on-chip per generare un modello di chip BBB personalizzato^15,16. Al fine di superare le sfide tecnologiche descritte, il Chip-S1 disponibile in commercio viene utilizzato insieme al modulo di coltura, uno strumento progettato per automatizzare la manutenzione dei chip in modo semplice e robusto (Emulate Inc.). Il chip BBB ricrea le interazioni tra cellule neurali ed endoteliali e raggiunge valori TEER fisiologicamente rilevanti, che vengono misurati da chip di organo su misura con elettrodi d’oro integrati¹⁷. Inoltre, il chip BBB mostra una bassa permeabilità paracellulare, risponde a segnali infiammatori a livello di organo, esprime pompe di flusso di efflusso attive e mostra il trasporto predittivo di biomarcatori solubili e biofarmaceutici. In particolare, i chip BBB generati da diversi individui catturano le differenze funzionali attese tra individui sani e pazienti con malattie neurologiche¹⁵.

Il protocollo descritto di seguito descrive un metodo affidabile, efficiente e riproducibile per la generazione di chip BBB basati su iPSC umani in condizioni di flusso dinamico. Vengono fornite indicazioni sul tipo di analisi dei saggi e degli endpoint che possono essere eseguite direttamente nel chip BBB o dagli effluenti di campionamento. Così, il protocollo dimostra lo spettro delle tecniche che possono essere applicate per la valutazione delle proprietà biologiche e funzionali e delle risposte in un modello rilevante per l’uomo.

Qui viene fornita una breve descrizione del chip BBB basato su iPSC. Gli iPSC umani sono inizialmente differenziati e propagati nei flaconi di coltura dei tessuti come aggregati a fluttuazione libera di progenitori neurali, indicati nelle sfere ez. Il canale superiore del Chip-S1^16,18,19 è seminato con sfere E sfere ez dissociate che formano il “lato cerebrale” del chip, in quanto le cellule si differenziano per 7 giorni in una coltura mista di cellule progenitrici neurali (iNPC), iAstrociti e iNeuron. Gli iPSC umani sono anche differenziati nelle piastre di coltura dei tessuti in iBMEC. Il canale inferiore del chip viene seminato con iBMEC per formare il “lato sangue” mentre si sviluppano per formare un tubo endoteliale (Figura 1). La membrana rivestita a matrice extracellulare porosa (ECM) che separa i canali superiore e inferiore 1) consente la formazione di interazioni tra cellule e cellule tra i canali e 2) consente all’utente di eseguire saggi permeabilità e celle di immagine in entrambi i canali utilizzando un microscopio luminoso convenzionale.

Protocol

1. Generazione di cellule progenitrici neurali derivate da iPSC (iNPC) Produrre sfere E z da colonie iPSC come descritto di seguito e come pubblicato in precedenza20,21,22. Coltura colonie iPSC alla confluenza su membrana seminterrato rivestito 6 lastre di pozzo (0,5 mg/piastra) in mTESR1 o altri supporti commerciali (vedi Tabella dei materiali). Rimuovere il mezzo iPSC e sostituire …

Representative Results

Figura 6A,B,C rappresenta un chip BBB seminato con sfere ez sul canale superiore “lato cervello” e iBMETsul canale inferiore “lato sangue”. Gli iBMEC sono stati prima di edte e hanno permesso di attaccarsi durante la notte, dopo di che sono state seminate le sfere dell’EZ. I trucioli sono stati poi coltivati in condizioni statiche con sostituzione giornaliera dei media per sette giorni. Il chip BBB è stato poi fissato utilizzando il 4% di PFA a RT per 10 min e lavato 3x con…

Discussion

La combinazione della tecnologia organ-on-chip e delle cellule derivate da iPSC nell’NVU promette una modellazione accurata della BBB umana. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l’applicazione semplice e robusta del chip BBB basato su iPSC recentemente pubblicato¹⁶. Una panoramica e la temporizzazione del paradigma di seeding è illustrato nella Figura 3. Per ottenere e mantenere funzioni di barriera adatte alla modellazione BBB, la generazione di un monostrato…

Materials

Accutase	EMD Millipore	SCR005	Dissociation solution
B27	Gibco	12587010
Bfgf	Peprotech	100-18B
Chip-S1	Emulate Inc	Chip-S1	Organ-Chip
Collagen IV	Sigma	C5533
DAPI	Invitrogen	D3571
Dextran-FITC	Sigma	46944
DMEM: F12	Thermo Fisher Scientific	31330038
Donkey serum	Sigma	D9663
Emulate Reagent 1 (ER-1)	Emulate Inc	ER-1
Emulate Reagent 2 (ER-2)	Emulate Inc	ER-2
Fibronectin	Sigma	F1141
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako	Z0334
GLUT-1	Invitrogen	MA5-11315
Glutamax	Life Technologies	35050038	Glutamine supplement
hBDNF	Peprotech	450-02
KOSR	Thermo Fisher Scientific	10828028
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	354234	Basement membrane matrix
mTeSR1	StemCell Technologies, Inc.	85851
NEAA	Biological industries	01-340-1B
Nestin	Millipore	MAB353
NutriStem	Biological industries	05-100-1A	Alternate media
PECAM-1	Thermo Fisher Scientific	10333
Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)	Biomedical Technologies	J64483AB
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625
S100β	Abcam	ab6602
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SCGP00525
Triton X-100	Sigma	X100
ZO-1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	33-9100
βIII-tubulin (Tuj1α)	Sigma	T8660
β-mercaptoethanol	Life Technologies	31350010