Analisi dei difetti cardiaci congeniti negli embrioni dei topi utilizzando metodi istologici qualitativi e quantitativi
Summary
In questo protocollo, descriviamo le procedure per analizzare qualitativamente e quantitativamente i fenotipi dello sviluppo nei topi associati a difetti cardiaci congeniti.
Abstract
I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono il tipo più comune di difetto alla nascita nell’uomo, che colpisce fino all’1% di tutte le nascite vive. Tuttavia, le cause alla base della CHD sono ancora poco conosciute. Il topo in via di sviluppo costituisce un modello prezioso per lo studio della CHD, perché i programmi di sviluppo cardiaco tra topi e esseri umani sono altamente conservati. Il protocollo descrive in dettaglio come produrre embrioni di topo dello stadio gestazionale desiderato, metodi per isolare e preservare il cuore per l’elaborazione a valle, metodi quantitativi per identificare i tipi comuni di CHD mediante istologia (ad esempio, setto ventricolare difetti, difetti del setto atriale, dotto brevettato arteriosus) e metodi di storitomorfometria quantitativa per misurare i fenotipi comuni della compattazione muscolare. Questi metodi articolano tutti i passaggi coinvolti nella preparazione, raccolta e analisi dei campioni, consentendo agli scienziati di misurare correttamente e riproducibilmente la CHD.
Introduction
Le CHD sono il tipo più comune di difetto alla nascita nell’uomo e sono la principale causa di decessi correlati ai difetti alla nascita1,2,3,4,5,6. Anche se circa il 90% dei neonati sopravvive alla CHD, è spesso associata a una significativa morbilità e interventi medici nel corso degli anni, imponendo un pesante onere alla vita dei pazienti e al sistema sanitario7,8,9,10. Al di fuori di fattori puramente genetici, le cause della CHD sono poco comprese4. Le cause non identificate rappresentano il 56-66% di tutti i casi di CHD secondo l’American Heart Association e altre fonti2,3,4,11. I fattori ben noti includono mutazioni genetiche, CNV, varianti a singolo nucleotide de novo e aneuploidia. Si sospetta che anche i fattori ambientali e dietetici siano fonti importanti che contribuiscono alla CHD, come suggerito da studi epidemiologici che collegano lo stile di vita materno2,12, privazione economica e razza13,e dalla ricerca su fattori come l’acido folico11,14 e l’acido retinoico lipidico bioattivo15,16. Lo studio dei meccanismi e delle cause della CHD e di altri difetti cardiovascolari è importante sviluppare strategie preventive e nuove opzioni terapeutiche1,4,17,18,19.
Il topo in via di sviluppo è un modello fondamentale per studiare la CHD nei mammiferi. Tuttavia, alcuni dei metodi e delle analisi impiegati, come le dissezioni che preservano la morfologia del cuore, l’analisi delle fasi di sviluppo e l’identificazione dei difetti associati alla CHD, possono essere scoraggianti per gli scienziati che sono nuovi all’analisi dei cuori murini. L’obiettivo dei metodi descritti in questo protocollo è quello di offrire linee guida qualitative e quantitative per questi processi. Così, in questo protocollo spieghiamo come eseguire accoppiamenti a tempo per produrre embrioni dello stadio gestazionale desiderato, sezionare le femmine incinte per il recupero del cuore intatto (compresi i tessuti associati come il tratto di deflusso), la fissazione del cuore e la preparazione per criostatista, metodi di istologia di base, analisi quantitative dei difetti cardiaci comuni e analisi qualitativa della compattazione del muscolo cardiaco, un fenomeno precursore comune ad alcuni tipi di CHD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo esplora le tecniche coinvolte nell’analisi dello sviluppo cardiaco nei cuori embrionali. Alcune limitazioni di questo metodo sono la destrezza fisica richiesta per le tecniche preparatorie, che possono richiedere pratica, e abilità con l’imaging al microscopio. Se le fette ottenute al criostato sono disordinate, la colorazione ematossialina ed eosina non sarà chiara, o se le immagini scattate al microscopio hanno scarsa illuminazione, il metodo utilizzato con ImageJ non funzionerà. Una limitazione de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’Aguirre Lab è supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health sotto il numero di premio K01HL135464 e dall’American Heart Association sotto il premio numero 19IPLOI34660342.
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
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