Nitel ve Nicel Histolojik Yöntemlerle Fare Embriyolarında Konjenital Kalp Defektlerinin Analizi
Summary
Bu protokolde, konjenital kalp defektleri ile ilişkili farelerde gelişimsel fenotipleri nitel ve nicel olarak analiz etme prosedürlerini açıklıyoruz.
Abstract
Konjenital kalp defektleri (KDE) insanlarda en sık görülen doğum kusuru türüdür ve tüm canlı doğumların %1’ini etkilemez. Ancak, CHD için altta yatan nedenler hala kötü anlaşılmaktadır. Gelişmekte olan fare CHD çalışması için değerli bir model oluşturmaktadır, fareler ve insanlar arasında kardiyak gelişim programları son derece korunur çünkü. Protokol, istenilen gebelik evresinde fare embriyolarının nasıl üretilebildiğini, kalbi aşağı işleme için izole etme ve koruma yöntemlerini, histoloji ile yaygın chd türlerini belirlemek için nicel yöntemlerin (örn. ventriküler septal) nasıl üretilmelerini ayrıntılı olarak açıklar. defektleri, atriyal septal defektler, patent ductus arteriosus) ve ortak kas sıkıştırma fenotiplerini ölçmek için kantitatif histomorfometri yöntemleri. Bu yöntemler, bilim adamlarının CHD’yi doğru ve tekrarlı bir şekilde ölçmelerine olanak tanıyan numune hazırlama, toplama ve analiz ile ilgili tüm adımları ifade edeyim.
Introduction
KDE’ler insanlarda en sık görülen doğum kusuru türüdür ve doğum kusuruna bağlı ölümlerin önde gelennedenidir 1,2,3,4,5,6. Yenidoğan çocukların yaklaşık% 90 ChD hayatta olmasına rağmen, sık sık hastalarınyaşamları ve sağlık sistemi7,8,9,10ağır bir yük empoze, yıllar içinde önemli morbidite ve tıbbi müdahaleler ile ilişkilidir. Tamamen genetik faktörlerin dışında, KCHD nedenleri kötü anlaşılmaktadır4. Tanımlanamayan nedenler Amerikan Kalp Derneği ve diğer kaynaklara göre tüm CHD olgularının ~ 56-66% için hesap2,3,4,11. Bilinen faktörler genetik mutasyonlar, CNVs, de novo tek nükleotid varyantları ve aneuploidi içerir. Bu çevresel ve diyet faktörleri de CHD katkıda önemli kaynaklar olduğundan şüphelenilmektedir, anne yaşam tarzı bağlayan epidemiyolojik çalışmalar tarafından önerilen2,12, ekonomik yoksunluk, ve ırk13, ve folik asit gibi diyet faktörleri içine araştırma tarafından11,14 ve biyoaktif lipid retinoik asit15,16. KCHD ve diğer kardiyovasküler defektlerin mekanizmaları ve nedenlerini araştırmak önleyici stratejiler ve yeni tedavi seçenekleri1,4,17,18,19geliştirmek için önemlidir.
Gelişmekte olan fare memelilerde CHD eğitimi için bir mihenk taşıdır modelidir. Ancak, kalp morfolojisini koruyan diseksiyonlar, gelişimevrelerinin analizi ve ChD ile ilişkili kusurların belirlenmesi gibi bazı yöntem ve analizler, murine kalpanalizinde yeni olan bilim adamları için yıldırıcı olabilir. Bu protokolde açıklanan yöntemlerin amacı, bu süreçler için nitel ve nicel yönergeler sunmaktır. Böylece, bu protokolde istenilen gebelik evresinde embriyo üretmek için zamanlanmış mikatların nasıl yapılacağını, sağlam kalp iyileşmesi için gebe leri nasıl inceleyeceğimizi (çıkış yolu gibi ilişkili dokular dahil), kalp fiksasyonu ve kriyostat kesit, temel histoloji yöntemleri, ortak kalp defektlerinin nicel analizleri ve kalp kası sıkıştırmasının nitel analizi, bazı KH türlerinin ortak öncüfenoti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, embriyonik kalplerde kardiyak gelişimanalizinde yer alan teknikleri inceler. Bu yöntemin bazı sınırlamaları, pratik gerektirebilir hazırlık teknikleri için gerekli fiziksel el becerisi ve mikroskop görüntüleme ile beceri vardır. Kriyostatta elde edilen dilimler dağınıksa, hematoksilin ve eozin boyama net olmayacaktır veya mikroskopta çekilen görüntülerde kötü Aydınlatma varsa, ImageJ ile kullanılan yöntem çalışmaz. ImageJ yazılımının eşik özelliğinin bir sınırlaması, pi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aguirre Lab Ulusal Kalp tarafından desteklenir, Akciğer, ve Kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri ödül numarası K01HL135464 altında ve Amerikan Kalp Derneği tarafından ödül numarası 19IPLOI34660342 altında.
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
Riferimenti
- Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al. Transplantation in the single ventricle population. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E. Four decades of Fontan palliation. Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge – A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood – Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- . Stage Definition Available from: https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998)
- Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017)
- . Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007)
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy. Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
