Her beskriver vi immunudfældning af ribosomer og tilhørende RNA fra udvalgte populationer af voksne mandlige musekimceller ved hjælp af RiboTag-systemet. Strategisk avl og omhyggelig immunudfældning resulterer i rene, reproducerbare resultater, der informerer om kimcellen stilbar og giver indsigt i mekanismerne i mutante fænotyper.
Kvantificering af forskelle i mRNA-tæthed er en klassisk tilgang til at forstå virkningen af en given genmutation på cellefysiologi. Men, karakterisere forskelle i oversætteome (hele oversatte mRNAs) giver et ekstra lag af oplysninger særligt nyttigt, når de forsøger at forstå funktionen af RNA regulere eller bindende proteiner. Der er udviklet en række metoder til at opnå dette, herunder ribosom profilering og polysome analyse. Begge metoder bærer imidlertid betydelige tekniske udfordringer og kan ikke anvendes på specifikke cellepopulationer i et væv, medmindre de kombineres med yderligere sorteringsmetoder. I modsætning hertil er RiboTag-metoden et genetisk baseret, effektivt og teknisk ligetil alternativ, der gør det muligt at identificere ribosomrelaterede RNA’er fra specifikke cellepopulationer uden tilsat sorteringstrin, forudsat at der findes en relevant cellespecifik Cre-driver. Denne metode består af avl til at generere de genetiske modeller, prøveindsamling, immunfældning og nedstrøms RNA-analyser. Her skitserer vi denne proces i voksne mandlige museceller mutant for et RNA bindende protein, der kræves for mandlig fertilitet. Der lægges særlig vægt på overvejelser om avl med fokus på effektiv koloniforvaltning og generering af korrekte genetiske baggrunde og immunudfældning for at reducere baggrunden og optimere produktionen. Diskussion af fejlfindingsmuligheder, yderligere bekræftelseseksperimenter og potentielle downstream-programmer er også inkluderet. De præsenterede genetiske værktøjer og molekylære protokoller er en effektiv måde at beskrive de ribosom-associerede RNA’er af specifikke cellepopulationer i komplekse væv eller i systemer med afvigende mRNA opbevaring og oversættelse med det formål at informere om de molekylære drivkræfter for mutant fænotyper.
Analyse af en celle eller vævs RNA-tæthed, som undersøgt af microarray eller RNA-sekventering, har vist sig at være et effektivt redskab til at forstå de molekylære drivkræfter bag mutantfænotyper. Disse relativt ufuldstændige analyseværktøjer kan dog ikke informeres om cellens fysiologi eller proteom, især i systemer, hvor mange mRNA’er opbevares før oversættelse såsom neurale og kimceller. I disse systemer, definere befolkningen af mRNAs bliver aktivt oversat til protein, eller cellens oversætteome, kan være en bedre indikator for cellens faktiske fysiologiske tilstand1,2. For eksempel, kimceller på forskellige stadier af udviklingen transskribere RNAs, der er gemt til senere oversættelse, drevet enten af udviklingsmæssige3 eller signalering signaler4. Denne proces eksemplificeres af mRNAs, der koder protaminer, hvor mRNA-udskriften kan påvises dage før proteinet fremstilles1,2,5,6. Ligeledes, neurale celler transskribere RNA i kernen og transportere det ned axon, som det er tilfældet med β-actin7. Ud over disse specialiserede cellesystemer, steady-state transforskrifter er usandsynligt, at være informativ i modeller, hvor RNA opbevaring, ribosom biogenese, eller mRNA oversættelse er påvirket. Flere andre faktorer kan også påvirke en celles steady-state RNA pool omfatter mRNA henfald og aktiviteten af RNA bindende proteiner. I disse tilfælde er der større sandsynlighed for, at robuste værktøjer til analyse af ribosomassocierede RNA’er eller mRNA’er under aktiv oversættelse giver biologisk relevante resultater.
Med henblik herpå er der udviklet flere metoder til at identificere ribosom-associerede eller aktivt oversatte meddelelser. Polysome profilering, som giver et øjebliksbillede af ribosom tilknyttede udskrifter, har været brugt i mange årtier til at isolere intakte RNAs forbundet med enten ribosomale underenheder eller mono-, di-, og poly-ribosomkomplekser3. Kort, indsamlede celle lysater påføres en lineær saccharose gradient og centrifugeret som høj hastighed, hvilket resulterer i adskillelse af ribosome underenheder, intakte ribosomer, og polysomer efter størrelse. Traditionelt er denne teknik blevet anvendt til at studere en eller et par mRNAs, men for nylig denne metode er blevet kombineret med RNA-seq undersøgelser for at belyse funktionen af potentielle translationelle regulatorer8,9 Mens en effektiv måde at skelne mellem aktivt oversætte og ikke-oversætte mRNAs10, polysome profilering kræver tidskrævende metoder (fraktion gradient og ultracentrifuge) og kan kræve en god del af prøven gør analysen af celle sjældne befolkninger udfordrende.
En alternativ tilgang til at undersøge oversætteomer er ribosom profilering, som identificerer de dele af udskrifter direkte forbundet med ribosomet. Kort sagt genereres ribosome tilknyttede RNA-fragmenter via RNase-beskyttelsesanalyse, individuelle ribosomkomplekser adskilt via saccharosegradient og tilhørende RNA-fragmenter isoleret og konverteret til RNA-seq-tags, der kan afstå ved dyb sekventering11. En af de vigtigste fordele for ribosomprofilering er evnen til at bestemme de specifikke steder af ribosomerne på tidspunktet for isolation, som gør det muligt at identificere oversættelse startsteder, beregning af ribosomal belægning og distribution, og identifikation af ribosom boder12. Men denne metode har flere iboende ulemper, herunder udstyr behov (gradient fraktionator og ultracentrifuge), en relativt kompleks protokol, der kræver omfattende fejlfinding, og beregningsmæssige spørgsmål ikke let håndteres af den uerfarne bruger11. Det er vigtigt, at ribosom profilering primært anvendes på isolerede celler i kultur og kræver betydeligt materiale, hvilket gør dens anvendelse på blandet celletype væv eller sorteret celler fra in vivo begrænset.
Den pattedyr RiboTag metode, udviklet af Sanz et al. i 200913, eliminerer en række spørgsmål iboende til både polysome og ribosom profilering. I denne metode kan ribosomassocierede RNA’er isoleres fra specifikke celletyper, der gør det muligt at undersøge celletypespecifikke oversætteomer i komplekse væv uden yderligere isolationsteknikker og specialiseret udstyr, som det er nødvendigt i andre metoder13,14. Grundlaget for RiboTag-metoden er en transgen musemodel (RiboTag), der bærer en modificeret locus til 60S ribosomelt subunit proteingen Rpl22. Dette locus (Rpl22-HA) omfatter en floxed terminal exon efterfulgt af en ekstra kopi af terminalexon ændret til at omfatte en C-terminal hemagglutinin (HA) tag inden for kodning regionen. Når den floxed exon krydses til en mus, der udtrykker en cellespecifik Cre Recombinase, fjernes den floxed exon, så udtrykket HA-mærket RPL22 udtrykkes på en cellespecifik måde (figur 1). HA-mærket kan derefter bruges til at immunforkaste (IP) ribosomer og deres tilknyttede RNA’er fra den valgte celletype.
Ud over den første publikation, der udviklede teknikken, har flere andre laboratorier udnyttet RiboTag-modellen. Diverse væv som mus Sertoli og Leydig celler15, microglia16, neuroner17,18, oocytter19, og dyrkede celler20 er blevet profileret og undersøgt. Selv om denne protokol er klart i stand til at isolere ribosomer og de tilhørende RNA’er på tværs af en forskelligartet vævstyper er der stadig områder, der kræver forbedringer, især når de anvendes på mutantsystemer. Især resulterer almindelig afhængighed af friskvæv i øget teknisk variation, som i høj grad kan reducere effekten af analysen. For det andet, sikker identifikation af differentieret oversat mål er gjort mere udfordrende, når høj immunfældning baggrund opstår fra ikke-Cre recombined celletyper som tidligere rapporteret13. Mens Sanz et al. manipuleret den grundlæggende forudsætning for teknikken, i dette manuskript Snyder laboratoriet præsenterer optimering af protokollen for at reducere disse bekymringer, hvilket gør metoden mere praktisk og effektiv.
Hensigten med denne artikel er at forklare trinene for avl mus udtrykke celle-specifikke HA-mærkede ribosomer, immunovergroning disse ribosomer fra flash-frosne prøver, og rense deres tilknyttede RNA’er for yderligere downstream analyser. Som pattedyr mandlige kimcelle og barnløshed mutation undersøgt give unikke udfordringer, har der gjort en indsats for at belyse måder denne teknik kan tilpasses andre cellesystemer.
Forståelse af oversætteome af en bestemt celletype er uvurderlig for mere præcist at forstå en celles fysiologi i normal eller mutant tilstand. Særlig fordel ses i systemer, hvor oversættelse er afkoblet fra transskription, såsom i neurale væv, hvor oversættelse næsker meget langt fra transskription, eller i kimceller, hvor transskription forekommer længe før oversættelse. I forhold til andre metoder til oversætteom analyse, RiboTag systemets største fordel kommer fra brugen af Cre rekombinase system. Dette giver frihed til at målrette enhver cellepopulation, der har en relevant Cre driver. For det andet er RiboTag IP som beskrevet heri effektiv og langt mindre teknisk udfordrende og tidskrævende end enten polyom eller ribosom profilering. Endelig kan RiboTag IP nemt udføres på bordpladen.
Der er en række kritiske trin i denne protokol. Chief blandt dem er etableringen af RiboTag muselinje og generation af forsøgsdyr til undersøgelse. Som for alle genetiske modeller, omhyggelig sporing af personer i musekolonien samt omhyggelig genoyping protokoller bør anvendes. PCR genotyping som pr. Sanz et al. bør omfatte primere rettet mod loxP site 5 ‘ af wildtype exon 4 at skelne mellem vilde alleler (260 bp) og mutant (290 bp)13. For RiboTag-analyse i kimcellemodeller bør meget specifikke avlskrav overholdes. For det første, i tilfælde af mutanter, der resulterer i barnløshed, tankevækkende avl strategier bør omfatte metoder til at optimere antallet af afkom med den ønskede genotype i mellemliggende og eksperimentelle generationer. For det andet bør der, når det drejer sig om kønscellespecifikke Cres,sørge for,at der tages hensyn til Cre-zygosity i betragtning af kønscellernes følsomhed over for Crettoksicitet. I kimcellen kan høje niveauer af Cre-protein have skadelige virkninger22, der forbyder brugen af Cre/Cre-dyr i avlsordningen. Endelig, når du bruger kimcelle Cres, er det vigtigt at isolere RiboTag allel fra Cre indtil den endelige generation som Cre udtryk i kimcellen af en mellemliggende generation vil resultere i afkom udtrykke Rpl22-HA globalt.
Uanset cellesystem er en række anbefalede kontroller mulige for at kontrollere robustheden af både Cre-udtryk og specificitet. Korrekt udtryk for din Cre og forventede excision af Rpl22-HA kan bestemmes ved hjælp af flere metoder. I den første kan væv isoleret fra forsøgsdyr farves for HA ved hjælp af enten immunhistokemi eller immunfluorescens15. Denne metode er optimal, idet den ikke kræver forudgående kendskab til oversatte mRNA’er i målcelletyperne. Den anden metode, som er et eksempel på, og som er vist i figur 6,kræver en vis viden om translationelle regulerede meddelelser i målcelletyperne. I denne metode kan berigelse af et kendt translationelt reguleret mRNA bekræftes fra den valgte Cre-driverved hjælp af kvantitativ PCR af IPed versus input RNA. På samme måde kan robust Rpl22-HA-udtryk bekræftes ved sammenligning af Cre+/Rpl22+ prøver (positive kontroller) med enten Cre-/Rpl22+ eller Cre+/Rpl22-prøver, der fungerer som effektive negative kontroller (se figur 3). Disse sammenligninger kan enten foretages på det samlede IPed RNA eller tilsætning for et kendt translationelt reguleret mRNA vurderet ved qRT-PCR eller en anden kvantitativ metode.
Almindelige problemer i udførelsen af protokollen har tendens til kun at vise sig, når RNA-udbyttet uventet er lavt eller højt. Den mest almindelige årsag til disse fejl opstår som følge af forkert genoyping af enkeltpersoner. Vi anbefaler, at yderligere væv fra den indsamlede prøve bevares for at bekræfte genotyper af alle prøver i tilfælde af uventede RNA-udbytter. Når det er bekræftet, bør andre muligheder overvejes, herunder muligheden for RNase-kontaminering eller nedbrydning af prøver. Omhyggelig prøveopbevaring og håndtering og vedligeholdelse af RNase-frizoner i laboratoriet kan i høj grad reducere eller eliminere disse problemer. Selv om RNA isolation spørgsmål er et andet potentielt problem i denne protokol, brugen af kommercielle kits i høj grad reducerer dette problem, selv om der bør udvises omhu for at sikre, at de opretholdes som RNase fri og indeholder ingen udløbne løsninger. Endelig, som med alle antistof-baserede procedurer, variationer i parti, opbevaring betingelser, koncentration, eller endda forsendelse har potentiale til at have en negativ indvirkning på kvaliteten af antistoffet og den efterfølgende succes pulldown. Som et resultat, efter omhyggelig og gentagen test, valgte vi den mest konsekvente og effektive antistof til rådighed.
Denne protokol indeholder to større ændringer i forhold til andre offentliggjorte RiboTag-protokoller, der i væsentlig grad øger sandsynligheden for succes. Den ene er evnen til at bruge flash frosset væv, og dermed afbøde eventuelle problemer, der involverer parti, tekniker, eller tekniske køre variationer. Prøver kan indsamles og opbevares, så der kan isoleres ha-ribosomer fra alle prøver på én gang, hvilket kan være vigtige kilder til variation. For det andet reducerer tilføjelsen af det foreløbige trin i væsentlig grad den form for baggrund, der rapporteres af andre brugere af RiboTag-systemet. For nylig, en protokol rapport fra Sanz et al. angiver tilstedeværelsen af høj baggrund på grund af overflod af ribosom-associerede udskrifter fraikke-Cre-drevneceller14. Vores protokol løser dette problem ved at inkludere et forclearingtrin, hvilket effektivt eliminerer tilstedeværelsen af RNA i Cre negative IP-prøver.
Som alle andre systemer bør ribotagsystemets iboende begrænsninger holdes for øje. Når du bruger ukarakteriserede Cre-drivere, skal der foretages analyse af udtryk før eksperimentel prøveproduktion. Set ud fra oversættelsens perspektiv skal der bemærkes flere nuancer af denne metode. For det første tillader RiboTag ikke differentiering mellem mRNA’er, der er klar til at oversætte, og dem, der aktivt oversætter. Som sådan tillader de nuværende RiboTag-baserede metoder ikke kvantificering af oversættelseseffektiviteten som funktion af de enkelte mRNA’er. Hvis oversættelseseffektiviteten er af interesse, kan den måles på et cellespecifikt grundlag, hvis RiboTag-metoden kombineres med andre oversætteanalyseværktøjer såsom polyen profilering. For det andet er det afgørende at tage hensyn til de samlede RNA-tæthedsændringer, der stammer fra den individuelle eller genotypeafhængige varians. Det er grunden til, at omhyggelig isolering af input RNA ledsage immunfudfældning og prøver stammer fra hver forblive parret i alle downstream analyser. Endelig og med hensyn til RiboTag-baseret analyse skal det erindres, at tilknytningen til et ribosin ikke nødvendigvis beviser, at der sker oversættelse. Der bør udføres sekundære analysemetoder for at bekræfte translationel regulering i interessemål.
Denne protokol beskriver isoleringen af ribosom-associerede RNAs fra kimceller af mandlige mus ved hjælp af RiboTag model. Ikke tegner sig for mus avl og prøve indsamling, protokollen tager to dage, med tre timer den første dag, bedst gøres om eftermiddagen, en overnatning inkubation, efterfulgt af fem timers arbejde den efterfølgende morgen. Det anbefales på det kraftigste, at forberedelse af lageropløsninger (HB og HSWB) samt vævsslibning sker på forhånd. Den samlede succes af protokollen er afhængig af korrekt genosoping og strengt RNase-fri betingelser. Evnen til at undersøge oversætte af specifikke celletyper vil gøre det muligt for fremtidige undersøgelser til bedre at forstå forholdet mellem transskription, oversættelse og proteom i utallige celletyper og mutant baggrunde.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud NICHD R00HD083521 til EMS og intern støtte fra Rutgers University til EMS.
1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
Dissection scissors | Preference of researcher | ||
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
Heat block | Preference of researcher | ||
Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
NP-40 Alternative – CAS 9016-45-9 – Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |