إصابة الدماغ الناجمة عن الليزر في القشرة الحركية للفئران
Summary
البروتوكول المعروض هنا يظهر تقنية لخلق نموذج القوارض من إصابات الدماغ. الطريقة الموصوفة هنا تستخدم تشعيع الليزر وتستهدف القشرة الحركية.
Abstract
تتضمن تقنية شائعة لحث السكتة الدماغية في نماذج القوارض التجريبية انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCA) العابر (غالباً ما يشار إليه باسم MCAO-t) أو دائم (يُعيّن باسم MCAO-p). غير أن هذه التقنية المقبولة عموماً لها بعض القيود، مما يحد من استخدامها على نطاق واسع. وغالبا ما يتميز تحريض السكتة الدماغية من خلال هذه الطريقة من قبل ارتفاع التباين في توطين وحجم منطقة الإقفاري، والحوادث الدورية من النزيف، وارتفاع معدلات الوفيات. كما أن النجاح في إنجاز أي من الإجراءات العابرة أو الدائمة يتطلب خبرة وغالباً ما يستمر لمدة 30 دقيقة تقريباً. في هذا البروتوكول، يتم تقديم تقنية تشعيع الليزر التي يمكن أن تكون بمثابة وسيلة بديلة لاستحثاء ودراسة إصابات الدماغ في نماذج القوارض.
بالمقارنة مع الفئران في مجموعات التحكم وMCAO ، أظهرت إصابة الدماغ عن طريق تحريض الليزر انخفاض التباين في درجة حرارة الجسم ، وحجم المزارع ، وذمة الدماغ ، والنزيف داخل الجمجمة ، والوفيات. وعلاوة على ذلك، تسبب استخدام إصابة ناجمة عن الليزر في تلف أنسجة المخ فقط في القشرة الحركية على عكس تجارب MCAO حيث لوحظ تدمير كل من القشرة الحركية والأنسجة النسترية.
تشير النتائج التي توصل إليها هذا التحقيق إلى أن التشعيع بالليزر يمكن أن يكون بمثابة تقنية بديلة وفعالة للحث على إصابة الدماغ في القشرة الحركية. الأسلوب أيضاً تقصير الوقت لإكمال الإجراء ولا يتطلب معالجات الخبراء.
Introduction
على الصعيد العالمي، السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي الثاني للوفاة والسبب الرئيسي الثالث للإعاقة1. كما تؤدي السكتة الدماغية إلى إعاقة شديدة، وغالباً ما تتطلب رعاية إضافية من الطاقم الطبي والأقارب. لذلك، هناك حاجة لفهم المضاعفات المرتبطة بالاضطراب وتحسين إمكانية تحقيق نتائج أكثر إيجابية.
استخدام النماذج الحيوانية هو الخطوة الأولى لفهم الأمراض. ولضمان أفضل نتائج البحوث، فإن النموذج النموذجي سوف يشمل تقنية بسيطة، والقدرة على تحمل التكاليف، وإمكانية التكاثر العالية، والحد الأدنى من التغير. وتشمل المحددات في نماذج السكتة الدماغية الإقفارية حجم وذمة الدماغ، وحجم الحفارة، ومدى انهيار حاجز الدم في الدماغ (BBB)، وضعف وظيفية تقييمها عموما عن طريق درجة شدة العصبية2.
تقنية تحريض السكتة الدماغية الأكثر استخداما في نماذج القوارض يُحل الشريان الدماغي الأوسط (MCA) بشكل عابر أو دائم3. تنتج هذه التقنية نموذج السكتة الدماغية مماثلة لتلك الموجودة في البشر: فقد penumbra المحيطة منطقة السكتة الدماغية، هو استنساخ عالية، وينظم مدة الإقفاريات وإعادة ضخ4. ومع ذلك، فإن طريقة MCAO لديها بعض التعقيدات. هذه التقنية عرضة للنزف داخل الجمجمة وإصابة شبكية العين ipsilateral مع خلل في القشرة البصرية وفرط الحرارة المشتركة التي غالبا ما تؤدي إلى نتائج إضافية5,6,7. وتشمل القيود الأخرى الاختلافات العالية في السكتة المستحثة (الناشئة عن التمديد المحتمل لاقفارية الإقفاريات إلى مناطق غير مقصودة، مثل منطقة الشريان السباتي الخارجية)، وعدم كفاية انسداد MCA، وإعادة التسريب السابق لأوانه. أيضا، الفئران من سلالات مختلفة وأحجام عرض مختلف وحدات التخزين في المزارع8. بالإضافة إلى جميع العيوب المذكورة، لا يمكن لنموذج MCAO أن يحفز السكتات الدماغية المعزولة الصغيرة في مناطق الدماغ العميقة، لأنها محدودة من الناحية الفنية من حيث متطلباتها من الحد الأدنى لحجم السفينة للقسطرة. وهذا يجعل الحاجة إلى نموذج بديل أكثر أهمية. طريقة أخرى، فوتوثرمومبوسيس، ويوفر بديلا محتملا لإجراءات MCAO ولكن لا يحسن على كفاءة9. هذه التقنية تستهدف السكتة الدماغية مع الضوء ويقدم بعض التحسينات على النماذج السابقة. ومع ذلك، يتطلب استئصال القحف الغازية التي ترتبط مع الكومبيات الثانوية9.
في ضوء أوجه القصور المبينة، يوفر البروتوكول المعروض هنا تقنية ليزر بديلة قادرة لحث إصابات الدماغ في القوارض. وتستند آلية عمل تقنية الليزر على آثار الليزر الحرارية الضوئية المنقولة على الأنسجة الحية ، مما يؤدي إلى امتصاص أشعة الضوء بواسطة أنسجة الجسم وتحويلها إلى حرارة. مزايا استخدام تقنية الليزر هي سلامته وسهولة التلاعب. قدرة الليزر على إنتاج الحرارة لوقف النزيف يجعلها مهمة جدا في الطب، في حين أن قدرته على تضخيم أشعة مختلفة في نقطة لقاء معين يضمن أن أشعة الليزر تجنب تدمير الأنسجة السليمة التي تقف في طريق الهدفنقطة 10. شعاع الليزر المستخدمة في هذا البروتوكول يمكن أن تمر من خلال وسيلة منخفضة السائل، مثل العظام، دون انبعاث الطاقة و / أو التسبب في أي تدمير. بمجرد أن تصل إلى وسيلة سائلة عالية ، مثل أنسجة الدماغ ، فإنها تستخدم طاقتها لتدمير الأنسجة المستهدفة. ولذلك، فإن هذه التقنية يمكن أن تحفز إصابات الدماغ فقط في المنطقة المناسبة من الدماغ.
وأظهرت التقنية المعروضة هنا قدرا هائلا من القدرة على تنظيم مستوياتها من الإشعاع، مما أدى إلى الاختلافات المختارة من إصابات الدماغ المقصود من البداية. على عكس MCAO الأصلي الذي يؤثر على كل من القشرة والمخطط ، كانت تقنية الليزر قادرة على تنظيم تأثير إصابة الدماغ ، مما أدى إلى الإصابة فقط على قشرة المحرك المقصودة. هنا، يتم توفير بروتوكول إصابات الدماغ الناجم عن الليزر وملخص للنتائج التمثيلية للإجراءات التي يتم إجراؤها على قشرة الدماغ للفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومن الإنصاف أن نفترض أن تقنية الليزر هي الحد الأدنى من الغازية، نظرا لأنه لم تحدث وفيات أو SAH في مجموعة الليزر. السبب الرئيسي للوفاة و SAH هو الضرر الذي لحق بالأوعية الدموية التي تؤدي إلى ارتفاع الضغط داخل الجمجمة (ICP) ، كما هو مبين في تقنيات MCAO الأصلية10. من المرجح أن يرجع غياب الم?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر قسم التخدير في المركز الطبي لجامعة سوروكا وموظفي المختبر في جامعة بن غوريون في النقب على مساعدتهم في أداء هذه التجربة.
Materials
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA – ALDRICH | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | SIGMA – ALDRICH | 76-03-9 | |
| Brain & Tissue Matrices | SIGMA – ALDRICH | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 1.83604E+11 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | SIGMA – ALDRICH | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | SIGMA – ALDRICH | HR-AZ/HR-A | |
| Digital Weighing Scale | SIGMA – ALDRICH | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | SIGMA – ALDRICH | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | SIGMA – ALDRICH | Z683884 | |
| Eppendorf Tube | SIGMA – ALDRICH | EP0030119460 | |
| Ethanol 96 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
| Evans Blue 2% | SIGMA – ALDRICH | 314-13-6 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | model Infinite 200 PRO multimode reader | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Infusion Cuff | ABN | IC-500 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 | |
| Multiset | TEVA MEDICAL | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | |
| Petri dishes | SIGMA – ALDRICH | P5606 | |
| Scalpel blades 11 | SIGMA – ALDRICH | S2771 | |
| Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine | Laser Industries Ltd | ||
| Stereotaxic head holder | KOPF | 900LS | |
| Sterile Syringe 2 ml | Braun | 4606027V | |
| Syringe-needle 27 G | Braun | 305620 |
Riferimenti
- World Health Organization. Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012. World Health Organization. 9, (2014).
- Meadows, K. L. Experimental models of focal and multifocal cerebral ischemia: a review. Reviews in the Neurosciences. 29, 661-674 (2018).
- Durukan, A., Strbian, D., Tatlisumak, T. Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development. Current Pharmaceutical Designs. 14, 359-370 (2008).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
- Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
- Zhao, Q., Memezawa, H., Smith, M. L., Siesjo, B. K. Hyperthermia complicates middle cerebral artery occlusion induced by an intraluminal filament. Brain Research. 649, 253-259 (1994).
- Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).
- Choi, B. I., et al. Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models. Environmental Toxicology and Pharmacology. 33, 60-69 (2012).
- Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedure Online. 21, 9 (2019).
- Bleilevens, C., et al. Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model. Experimental Brain Research. 224, 155-164 (2013).
- Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. (147), e58875 (2019).
- Boyko, M., et al. Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke. Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).
