Лазерная травма головного мозга в моторном кортексе крыс

Summary

Протокол, представленный здесь показывает технику создания модели грызунов черепно-мозговой травмы. Описанный здесь метод использует лазерное облучение и нацелен на моторную кору.

Abstract

Общий метод индуцирования инсульта в экспериментальных моделях грызунов включает в себя переходный (часто обозначаемый как MCAO-t) или постоянный (обозначенный как MCAO-p) окклюзия средней мозговой артерии (MCA) с помощью катетера. Однако этот общепринятый метод имеет некоторые ограничения, что ограничивает его широкое применение. Индукция инсульта с помощью этого метода часто характеризуется высокой изменчивостью локализации и размера ишемической области, периодическими случаями кровоизлияния и высокими показателями смертности. Кроме того, успешное завершение любой из переходных или постоянных процедур требует опыта и часто длится около 30 минут. В этом протоколе представлена техника лазерного облучения, которая может служить альтернативным методом для индуцирования и изучения черепно-мозговой травмы в моделях грызунов.

По сравнению с крысами в контрольных и MCAO групп, черепно-мозговая травма лазерной индукции показали снижение изменчивости температуры тела, объема инфаркта, отек мозга, внутричерепное кровоизлияние, и смертность. Кроме того, использование лазерной индуцированной травмы вызвало повреждение тканей головного мозга только в моторной коре, в отличие от экспериментов MCAO, где наблюдается разрушение как моторной коры, так и стриатальных тканей.

Результаты этого исследования показывают, что лазерное облучение может служить в качестве альтернативного и эффективного метода для индуцирования черепно-мозговой травмы в моторной коре. Метод также сокращает время завершения процедуры и не требует опытных обработчиков.

Introduction

Во всем мире инсульт является второй по величине причиной смерти и третьей по счету причиной^{инвалидности 1.} Инсульт также приводит к тяжелой инвалидности, часто требующей дополнительной помощи со стороны медицинского персонала и родственников. Существует, следовательно, необходимо понять осложнений, связанных с расстройством и улучшить потенциал для более положительных результатов.

Использование моделей животных является первым шагом к пониманию заболеваний. Для обеспечения наилучших результатов исследований типичная модель будет включать простую технику, доступность, высокую воспроизводимость и минимальную изменчивость. Детерминанты в моделях ишемического инсульта включают объем отеков мозга, размер инфаркта, степень распада гемового барьера (BBB) и функциональные нарушения, обычно оцениваемые с помощью неврологического балла^{тяжести 2.}

Наиболее широко используемая методика индукции инсульта в моделях грызунов затмевает среднюю мозговую артерию (MCA) преходяще или постоянно^3. Этот метод производит модель инсульта похож на те, в организме человека: он имеет полутени, окружающие погладил области, является весьма воспроизводимой, и регулирует продолжительность ишемии и reperfusion⁴. Тем не менее, метод MCAO имеет некоторые осложнения. Техника склонна к внутричерепным кровоизлияниям и повреждению ипсилатеральной сетчатки с дисфункцией зрительной коры и общей гипертермией, что часто приводит к^{дополнительным исходам 5,,6,,7.} Другие ограничения включают высокие различия в индуцированном инсульте (в результате вероятного распространения ишемии на непреднамеренные регионы, такие как область внешней сонной артерии), недостаточное окклюзии MCA, и преждевременное реперфузии. Кроме того, крысы различных штаммов и размеров обладают различными инфарктными томами^8. В дополнение ко всем упомянутым недостаткам, модель MCAO не может вызвать небольшие изолированные инсульты в глубоких областях мозга, поскольку она технически ограничена с точки зрения требования минимального размера сосуда для катетеризации. Это делает потребность в альтернативной модели еще более критической. Другой метод, фототромбоз, обеспечивает возможную альтернативу процедурам MCAO, но не повышает эффективность^9. Этот метод цели инсульта со светом и предлагает некоторые улучшения на предыдущих моделях. Тем не менее, фототромбоз требует инвазивной краниотомии, которая связана со вторичными compications⁹.

В свете изложенных недостатков представленный здесь протокол предоставляет способную альтернативную лазерную технику для индуцирования черепно-мозговой травмы у грызунов. Механизм действия лазерной техники основан на фототермальных эффектах лазера на живые ткани, что приводит к поглощению световых лучей тканями организма и их превращению в тепло. Преимущества использования лазерной техники являются его безопасность и простота манипуляции. Способность лазера производить тепло, чтобы остановить кровотечение делает его очень важным в медицине, в то время как его способность усиливать различные лучи в данной точке встречи гарантирует, что лазеры избежать уничтожения здоровых тканей, что стоит на пути точки^{мишени 10}. Лазерный луч, используемый в этом протоколе, может проходить через низкую жидкую среду, такую как кость, не излучая ее энергию и/или не вызывая никаких разрушений. Как только он достигает высокой жидкой среды, такой как ткани мозга, он использует свою энергию, чтобы уничтожить ткани-мишени. Техника, таким образом, может вызвать черепно-мозговую травму только в соответствующей области мозга.

Техника, представленная здесь, показала огромную способность регулировать свои уровни облучения, производя выбранные вариации черепно-мозговой травмы, предназначенные с самого начала. В отличие от оригинального MCAO, который влияет как коры и стриатума, лазерная техника была в состоянии регулировать воздействие черепно-мозговой травмы, вызывая травмы только на предполагаемой моторной коры. В этом случае предусмотрен протокол о лазерной черепно-мозговой травме и резюме репрезентативных результатов процедуры, выполняемой на коре головного мозга крыс.

Protocol

Следующая процедура была проведена в соответствии с Руководящими принципами использования экспериментальных животных Европейского сообщества. Эксперименты были также одобрены Комитетом по уходу за животными в Университете Бен-Гуриона в Негеве. 1. Отбор и подготовка жи?…

Representative Results

Ни в контрольных, ни в экспериментальных группах (таблица1)не было зарегистрировано ни одного случая смерти или SAH. Уровень смертности в группе MCAO составил 20%. Относительные изменения температуры тела у крыс обеих групп также были похожи, несмотря на разницу в изм…

Discussion

Справедливо предположить, что лазерная техника является минимально инвазивной, учитывая, что никаких смертей или SAH не произошло в лазерной группе. Основной причиной смерти и SAH является повреждение кровеносных сосудов, что приводит к повышению внутричерепного давления (ICP), как показа?…

Materials

2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	SIGMA – ALDRICH	298-96-4
50% trichloroacetic acid	SIGMA – ALDRICH	76-03-9
Brain & Tissue Matrices	SIGMA – ALDRICH	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P	SIGMA – ALDRICH	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	SIGMA – ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale	SIGMA – ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA – ALDRICH	Z265969
Eppendorf pipette	SIGMA – ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA – ALDRICH	EP0030119460
Ethanol 96 %	ROMICAL		Flammable Liquid
Evans Blue 2%	SIGMA – ALDRICH	314-13-6
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F
Petri dishes	SIGMA – ALDRICH	P5606
Scalpel blades 11	SIGMA – ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine	Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder	KOPF	900LS
Sterile Syringe 2 ml	Braun	4606027V
Syringe-needle 27 G	Braun	305620