På grænsefladen af organiske og vandige opløsningsmidler samles skræddersyede amfifile elastin-lignende proteiner i komplekse supramolekylære strukturer såsom vesikler, fibre og coacervater udløst af miljømæssige parametre. De beskrevne montageprotokoller giver Protein Membrane-Based Compartments (PMBC’ er) med tunable-egenskaber, hvilket muliggør indkapsling af forskellige laster.
Skræddersyede proteinholdige byggesten er alsidige kandidater til samling af overmolekylære strukturer såsom minimale celler, lægemiddelleveringskøretøjer og enzymstilladser. På grund af deres biokompatibilitet og tunabilitet på det genetiske niveau er Elastin-lignende proteiner (ELP) ideelle byggesten til bioteknologiske og biomedicinske anvendelser. Ikke desto mindre er samling af proteinbaserede supramolekylære strukturer med forskellige fysiokemiske egenskaber og gode indkapslingspotentiale fortsat udfordrende.
Her leverer vi to effektive protokoller for guidet selvsamling af amfifile ELPs i supramolekylære proteinarkitekturer som sfæriske coacervates, fibre og stabile vesikler. De præsenterede montageprotokoller genererer proteinmembranbaserede rum (PMBC’er) baseret på ELPs med fleksible fysisk kemiske egenskaber. PMBC’er demonstrerer faseseparationsadfærd og afslører metodeafhængig membranfusion og er i stand til at indkapsle kemisk mangfoldige fluorescerende lastmolekyler. De resulterende PMBC’er har et højt applikationspotentiale som lægemiddelformulering og leveringsplatform, kunstig celle og opdelt reaktionsrum.
Samling af overmolekylære strukturer til bioteknologiske anvendelser får stadig større betydning1,2,3,4,5. Til samling af funktionelle arkitekturer som coacervater, vesikler og fibre med ønskede fysisk-kemiske egenskaber er det vigtigt at forstå og kontrollere komponenternes fysisk-kemiske og konformationelle egenskaber. På grund af molekylpræcisionen af molekyler, der findes i naturen, er byggestenene til supramolekylære strukturer i stigende grad baseret på lipider, nukleinsyrer eller proteiner. Sammenlignet med syntetiske polymerer giver proteinholdige byggesten mulighed for præcis kontrol over spirende supramolekylære strukturer6 på det genetiske niveau. Den primære aminosyresekvens (aa) af de enkelte proteinbyggestener koder i sig selv informationen for deres samlingspotentiale fra molekylop til makroskopisk niveau samt den tredimensionelle form og fysiske egenskaber af den endelige overmolekylære struktur7.
Rapporterede metoder til samling af forskellige supramolekylære strukturer involverer ofte amfifile proteiner såsom temperaturfølsomme elastin-lignende proteiner (ELP)5,8,9, rekombinant oleosin10og kunstige proteinamfifile11. Temperatur udløste metoder har ført til samling af micelles4,10,12Fibre13Ark14og vesikler9,15,16. Metoder, der involverer organiske opløsningsmidler, er blevet anvendt til dannelse af dynamiske proteinbaserede vesikler8,11,14. Hidtil anvendes protokoller for vesikel dannelse ofte mangler samling kontrol over mikrometer mellemstore forsamlinger16,17eller har begrænset samlingudbytte5. Desuden har nogle rapporterede ELP-baserede vesikler forringet indkapslingspotentialet12eller begrænset stabilitet over tid9. Løse disse ulemper, de præsenterede protokoller muliggøre selv-samling af mikrometer og sub mikrometer størrelse supramolekylære strukturer med forskellige fysiokemiske egenskaber, god indkapsling potentiale og lang tid stabilitet. Skræddersyede amfifile ELPs samles i supramolekylære strukturer, der spænder over området fra sfæriske coacervates og højt bestilte snoede fiberbundter til unilamellar vesikler afhængigt af den anvendte protokol og tilhørende miljøforhold. Store vesikulære proteinmembranbaserede rum (PMBC) afslører alle de vigtigste fænotyper såsom membranfusion og faseseparationsadfærd svarende til liposomer. PMBC’er indkapsler effektivt kemisk forskellige fluorescerende lastmolekyler, som kan overvåges ved hjælp af simpel epifluorescensmikroskopi. De gentagne ELP-domæner, der anvendes i denne undersøgelse, er attraktive byggesten for proteinbaserede supramolekylære arkitekturer18. ELP pentapeptid repeat unit (VPGVG) er kendt for at tolerere forskellige aa udover proline på den fjerde position (valin, V), samtidig med at dens strukturelle og funktionelle egenskaber19. Udformningen af amfifile ELPs indeholdende karakteristiske hydrofile og hydrofobiske domæner blev realiseret ved at indsætte aa gæst rester (X) i VPGXG gentage med særskilt hydrophobicity, polaritet, og afgift20. Amphiphilic ELP domæner, hvor udstyret med hydrofob phenylalanin (F) eller isoleucine (I), mens den hydrofile domæne indeholdt opkrævet glutaminsyre (E) eller arginin (R) som gæst rester. En liste over støtteberettigede amfifile ELP konstruktioner og tilsvarende aa sekvenser kan findes i de supplerende oplysninger og referencer8,21. Alle byggesten, hvor udstyret enten med små fluorescerende farvestoffer eller fluorescerende proteiner til visualisering via fluorescens mikroskopi. mEGFP og andre fluorescerende proteiner blev N-terminalt smeltet til de hydrofile domæner af ELP amfifile . Organiske farvestoffer blev konjugeret via kobber-fri stamme fremmes alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) til en co-translationelt indført unaturlig aminosyre (UAA). Den samoversættelse af ULApara-azidophenylalanin (pAzF)22n-terminal-ændring af det hydrofile ELP-domæne. På denne måde er det grønne fluorescerende farvestof BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) eller et lille fluorescerende molekyle med en anstrengt cyclooctyne kan anvendes som fluorescerende sonde. Vellykket inkorporering af UAA pAzF og cycloaddition af farvestoffet via SPAAC kan let bekræftes via LC-MS/MS på grund af effektiv ionisering af de tilsvarende tryptiske peptider8. Dette lille organiske farvestof blev anvendt til at udvide valget af opløsningsmiddel til samleprotokoller, da fluorescerende proteiner er uforenelige med de fleste organiske opløsningsmidler. De to mest effektive montageprotokoller til overmolekylære strukturer, der er udviklet i vores laboratorium, er beskrevet nedenfor. THF hævelse metode er kun kompatibel med organisk farvestof modificeret amfifile ELP. I modsætning hertil er ekstruderingsmetoden 1-butanol (BuOH) kompatibel med mange proteiner som fluorescerende sonde fx mEGFP, da den beskrevne metode fuldt ud bevarer fluorescensen af disse fusionsproteiner. Desuden fungerer indkapslingen af små molekyler og vesikulær fusionsadfærd bedst ved at anvende BuOH ekstruderingsmetoden.
En fejl, der følger de beskrevne protokoller for samling af definerede overmolekylære strukturer, fører hovedsagelig enten til dannelsen af uspecifikke aggregater (figur 2,IV) eller til homogent distribuerede ELP-amfifile. Kritiske trin i protokollen er beskrevet nedenfor:
For højt udtryksudbytte af den amfifile ELP er en relativt lav temperatur på 20°C optimal. For vellykket affinitet baseret rensning af den amfifile ELP en urinstof koncentration på 4 M i …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker BMBF for finansiel støtte og Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) for at yde forskningsfaciliteten. Vi er taknemmelige for P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Californien, USA for at give plasmid pEVOL-pAzF. Vi takker personalet i Life Imaging Center (LIC) i Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) af Albert-Ludwigs-University Freiburg for hjælp med deres konfokale mikroskopi ressourcer, og den fremragende støtte i billedoptagelse.
1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
2log DNA ladder | NEB | ||
2-Mercaptoethanol | Roth | ||
50 mL Falcon tubes | VWR | ||
79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
Acetic acid glacial | VWR | ||
Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
Biofuge | Heraeus | ||
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
BspQI | NEB | ||
Camera DS Qi1 | Nikon | ||
Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
Chloramphenicol | Roth | ||
CompactStar CS 4 | VWR | ||
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
Digital sonifier | Branson | ||
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
Dnase I | Applichem | ||
EarI | NEB | ||
EcoRI-HF | NEB | ||
Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
Ethanol absolute | Roth | ||
Ethidium bromide solution | Roth | ||
Filter supports | Avanti | ||
Glass plates | Bio-Rad | ||
Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
Glycin | Applichem | ||
H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
HindIII | NEB | ||
HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
Illuminator ix 20 | INTAS | ||
Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
Imidazole | Merck | ||
Immersions oil for microscopy | Merck | ||
Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
Inkubator 1000 | Heidolph | ||
IPTG, >99% | Roth | ||
Kanamycinsulfate | Roth | ||
L(+)-Arabinose | Roth | ||
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
LB-Medium | Roth | ||
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
Microscope CM 100 | Philips | ||
Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
Microscopy slides | VWR | ||
Microwave | Studio | ||
Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
PH meter 766 calimatic | Knick | ||
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
PowerPac basic | BioRad | ||
Propanol-2-ol | Emplura | ||
Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
Reinforcement rings | Herma | ||
SacI HF | NEB | ||
SDS Pellets | Roth | ||
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
T4 DNA Ligase | NEB | ||
TEMED | Roth | ||
TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
Thermomix comfort | Eppendorf | ||
THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
Triton X 100 | Roth | ||
Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
Ultrasonic cleaner | VWR | ||
Urea p.a. | Roth | ||
Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
XbaI | NEB | ||
XhoI | NEB | ||
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |