Protokollet presenterar utnyttjande av den kemiska biopsi strategi följt av omfattande metabolomic och lipidomic analys för kvalitetsbedömning av njure ympkvistar tilldelas för transplantation.
Njurtransplantation är en livräddande behandling för ett stort antal personer med slutstadiet njurfunktionsstörning över hela världen. Förfarandet är förknippat med en ökad överlevnad och högre kvalitet på patientens liv jämfört med konventionell dialys. Beklagligt, transplantationsologi lider av en brist på tillförlitliga metoder för organkvalitet bedömning. Standard diagnostiska tekniker är begränsade till makroskopiska utseende inspektion eller invasiv vävnad biopsi, som inte ger omfattande information om transplantatet. Det föreslagna protokollet syftar till att införa solid fas mikroextraktion (SPME) som en idealisk analysmetod för omfattande metabolomik och lipidomic analys av alla lågmolekylära föreningar som finns i njurar som tilldelats för transplantation. Den lilla storleken på SPME-sonden möjliggör prestanda hos en kemisk biopsi, vilket möjliggör utvinning av metaboliter direkt från organet utan vävnadsuppsamling. Den minsta invasivitet av metoden tillåter utförande av flera analyser över tiden: direkt efter organ skörd, under dess bevarande, och omedelbart efter revascularization på mottagarens kropp. Det är en hypotes om att kombinationen av denna nya provtagningsmetod med en högupplöst masspektrometer kommer att möjliggöra diskriminering av en uppsättning karakteristiska föreningar som skulle kunna fungera som biologiska markörer för graft kvalitet och indikatorer för eventuell utveckling av organ dysfunktion.
Enligt United States’ Organ Procurement and Transplantation Network, fanns det 94 756 patienter som väntade på njurtransplantationer i USA under 2019; medan det i Europa 2018 var den siffran 10 791. Var tionde minut läggs någon till den nationella väntelistan för transplantationer i USA, och det uppskattas att 20 personer dör varje dag i väntan på en transplantation1,2. Njurtransplantation är en livräddande behandling för ett stort antal människor som lider med slutstadiet njurfunktionsstörning över hela världen. Förfarandet är associerat med ökad överlevnad och högre livskvalitet vid jämförelse med konventionell dialys.
Transplantation står dock inför många allvarliga problem, såsom organbrist eller brist på effektiva verktyg för organkvalitetsbedömning. Standardprotokollen är begränsade till makroskopisk utseendeinspektion eller invasiv vävnadsbiopsi, som inte ger omfattande information angående ympkvistens kvalitet. Medan en visuell bedömning möjliggör identifiering av tumörer synliga för ögat, anatomiska avvikelser, eller omfattande skador på ympkvistar, detta tillvägagångssätt är mycket subjektiva, varierande i sin effektivitet enligt erfarenheterna av observatörerna. Biopsi, å andra sidan, kan ge värdefull information om befintliga njursjukdomar, och anses därmed vara en metod för objektiva och bestyrk värde i fastställandet av transplantat resultat. Men, biopsiförfarandet är inte fri från brister; det finns risk för potentiella komplikationer såsom blödning och ytterligare 4-5 timmars provberedning krävs, vilket avsevärt förlänger den kalla ischemisk tid. Därför, särskilt i Europa, är användningen av direkt vävnadsanalys begränsad till utökade kriterier givare (ECD) och givare efter cirkulationsdöd (DCD)3,4.
Metabolomik och lipidomics har nyligen erkänts som lovande metoder för att uppnå en bättre förståelse av förändringarna i biokemiska vägar som förekommer under orgel bevarande. Metabolomisk och lipidomisk profilering möjliggör övervakning av omedelbara svar av systemet på plötsliga miljöförändringar relaterade till avlägsnande av organ med efterföljande konsekvenser: ischemi, oxidativ stress, eller inflammatoriska svar5,6,7,8. Njuren är ett organ som till stor del är associerat med metaboliska processer, således mätningar av metaboliter och lipider koncentrationer kan tillåta identifiering av potentiella organ kvalitet biomarkörer och möjliggöra bättre förutsägelser av transplantat resultatet.
Med tanke på ovanstående komplikationer och begränsningar i samband med nuvarande organkvalitet bedömningsmetoder, en mindre invasiv diagnostisk lösning behövs för snabb och komplex organkvalitet bedömning. Solid phase microextraction (SPME) uppfyller dessa krav som en minimalt invasiv analysmetod som möjliggör täckning av ett brett spektrum av metaboliter och lipider. Tekniken baseras på insättning av en tunn (~200 μm), biokompatibel, titan-nickellegeringssond täckt med en selektiv extraktionsfas i det undersökta organet under en kort tid. Det bör betonas att SPME förhindrar proteinutvinning, och möjliggör därmed metabolismhämning redan i det skede av provinsamlingen, vilket är en betydande fördel jämfört med alternativa metoder. Dessutom möjliggör miniatyriseringen av enheten för utförande av repetitiva och samtidiga analyser av få strukturer av organet9,10,11.
Utvärdering av organkvalitet är fortfarande en stor utmaning för läkare, som måste fatta snabba välgrundade beslut om huruvida ett visst organ är lönsamt för transplantation eller om det måste kasseras. Flera faktorer, såsom givare ålder, varaktighet ischemi, och infektioner och inflammatoriska processer, kan påverka den långsiktiga transplantat resultatet. Medan olika metoder har utvecklats hittills för att diagnostisera njure allograft funktion, förblir histopatologisk inspektion guldmyntfoten i denfrågan 3,4,12. Även om biopsi förfarandet kan ge betydande information om redan existerande givare sjukdom och Vaskulär förändringar, är det inte fri från brister. Provtagningsfel som är associerade med interobservervariation och provtagning av otillräcklig glomeruli för omfattande information avseende organfunktion förblir typiska farhågor i detta avseende. Dessutom medför preparat för exemplar vissa frågor såsom en ofullständig bedömning av transplantatet vid frysta avsnitt, och förlängning av förfarandet tid för paraffin snittning. Den ökade risken för blödning, som kan verka akut som mikroskopisk eller grov hematuri, är dock den stora livshotande komplikationen som är associerad med biopsiförfarandet. Av denna anledning är antalet tillåtna biopsier strikt begränsad i transplantation förfaranden, en faktor som hämmar avskiljning av dynamiska förändringar och tidsserieanalyser via denna metod12,13,14. Nyttan av en histologisk analys måste vägas mot de risker som är förknippade med metoden. Värdet av histologiska fynd är obestridligt, men de förklarar inte de molekylära mekanismerna i avvikelserna.
Metabolomik och lipidomics är de yngsta domänerna av “-omics” vetenskaplig familj. Den kompletta uppsättningen av lågmolekylära (<1200 Da) mänskliga metaboliter och lipider anslutna inom ett metaboliskt nätverk definieras som en mänsklig metabolom. Genomet förblir relativt konstant under hela sin livstid, med små ändringar som orsakas av mutationer som förekommer sällan. Metabolomet är produkten av genuttryck, som är mycket känslig för förändringar i alla biologiska processer samt miljöfaktorer. Den dynamiska karaktären hos metaboliter och lipider gör dem perfekta indikatorer på nuvarande organ skick7,8,15,16. Den SPME-metod som föreslås i ovannämnda protokoll möjliggör detektering av förändringar som sker i organet under dess bevarande, med början från organborttagning från donatorns kropp tills revaskularisation hos mottagaren. Sondens lilla diameter (~200 μm) ger minimal invasivitet och möjliggör flera provtagningar från samma organ utan att orsaka någon skada på vävnaden. Genomförande av studier med njure, som det mest transplanterade organet, möjliggör en bättre förståelse och ytterligare karakterisering av de metaboliska vägar som ansvarar för att minska ympkvistarnas kvalitet och funktion. Möjligheten att övervaka modifieringar över tiden är säkert en viktig fördel med tekniken jämfört med konventionella invasiva metoder såsom biopsi. Den för närvarande presenterade analysen identifierade förändrade koncentrationer av olika grupper av lipider och metaboliter, särskilt av essentiella aminosyror, puriner, purinnukleosider och glycerofosfolipider. Dessa resultat överensstämmer med tidigare vävnadsanalysrapporter5,6,17,18,19,20. Hittills har majoriteten av vetenskapliga rapporter utnyttja metabolomik eller lipidomics att förklara processer inducera komplikationer efter transplantation eller ischemi / reperfusion skada (IRI) fenomen har begränsats till analys av biofluider21,22,23.
Varje klinisk tillämpning kräver optimering av provtagningsprotokollet för att säkerställa att analysmetodens prestanda uppfyller förväntade kriterier. I detta avseende är fördelen med att utnyttja SPME möjligheten att justera förutsättningar för olika experimentella konstruktioner. Mångfalden av tillgängliga extraktionsfaser ger ett brett spektrum av extraherade metaboliter med diversifierade polariteter. Samtidigt kan detta anses vara en begränsning av metoden på grund av att varje sorbent ger selektivitet mot specifika egenskaper och inte extraherar alla föreningar som finns i provmatrisen. Det bör noteras att SPME beläggningar extrahera endast via fria molekyler, och helt enkelt inte interagerar med en bunden fraktion av analyten. Beläggningarnas biokompatibilitet inför inte toxicitet för vävnaden samtidigt som man håller fast utvinningen av stora molekyler som proteiner; som en konsekvens hämmas de enzymatiska processerna redan i provsamlingsskedet och förekomsten av artefakter minimeras, vilket är en stor fördel jämfört med alternativa provtagningsmetoder. Beläggningens längd påverkar effektiviteten vid extraktion (dvs. beläggningens längd betecknar ytan och utsugningsfasvolymen); alltså ger längre beläggningar högre återvinningar. Å andra sidan möjliggör kortare beläggningar högre rumslig upplösning. För tillförlitliga resultat är det avgörande att dränka sonden till exakt samma djup av njurbarken. Insättning för djup orsakar risk för att komma in i njuren medulla. Tiden för extraktionen står också i proportion till extraktionseffektiviteten. Därför är val av optimal utvinningstid ett av de mest kritiska stegen i SPME-metodutveckling. Tidsmätningens noggrannhet ger högsta repeterbarhet. I biologiska tillämpningar som den som diskuteras finns det alltid en kompromiss mellan känsligheten och repeterbarheten hos det analytiska protokollet och begränsningarna i det medicinska förfarandet. Medan jämviktsextraktion ger högsta känslighet, av säkerhetsskäl, används pre-jämviktsförhållanden ofta i sådana tillämpningar, eftersom extraktionstiden inte bör påverka den totala varaktigheten av operationen. Effektiviteten av desorption bestäms av processens tid och desorptionslösningsmedlets sammansättning, som bör vara kompatibel med den mobila fas som används för kromatografisk separation9,10,11.
Ett av de stora kraven för diagnostisk instrumentering som används för intrakirurgiska bedömningar är tid för analys. Man försöker med nuvarande försök att utveckla ett snabbt verktyg för in vivo SPME-utsug som kopplas direkt till en masspektrometer via moi- (microfluidic open interface)24 eller belagda bladspray (CBS)25. Sådana tillvägagångssätt skulle möjliggöra utlämnande av analysresultat i verklig eller nära realtid. Användningen av sådana metoder för analyser före intervention av metaboliska och lipidomic profiler skulle kunna förbättra beslutsprocessen under transplantation förfaranden, möjliggör bästa möjliga personlig strategi och snabb respons vid organsvikt.
Som en sammanfattning, det är en hypotes om att det föreslagna protokollet kommer att möjliggöra uppnåendet av full metaboliska och lipidomic profiler av njure ympkvistar, vilket i sin tur skulle ge en omfattande bedömning av organ kvalitet och karakterisering av de processer som ansvarar för ischemi-reperfusion skada. Projektets nyhet omfattar utnyttjande av solid-phase microextraction (SPME), som erbjuder låg invasiv provtagning av levande system, i kombination med en av de mest innovativa teknikerna som finns för metabolomik och lipidomics-analys (t.ex. Orbitrap-masspektrometern med hög upplösning). SPME kombinerar provsamling, extraktion och släckning av metaboliter i ett steg, vilket gör det därför till ett perfekt verktyg för snabb analys. Det förväntas att detta protokoll kommer att bidra till att svara på frågor som rör vad pre-transplant villkor av njure är ansvariga för fördröjd organfunktion eller dess dysfunktioner efter transplantation, samt till hur transplantatet bevarande protokollet påverkar biokemi av organet. Sådan kunskap skulle inte bara ha betydande inverkan på förebyggandet av eventuella komplikationer relaterade till transplantation, men kan bidra till att förbättra nuvarande graft bevarande protokoll, minimera förlust av livskraftig transplantation vävnad samt förlust av liv. Den föreslagna lösningen kommer att öppna dörren för ytterligare undersökningar på detta område, inklusive validering av specifika potentiella biomarkörer och förbättring av terapeutiska resultat inom transplantationsologi.
The authors have nothing to disclose.
Studien fick stöd av anslag Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 från National Science Centre. Författarna vill erkänna MilliporeSigma, ett företag av Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland för att tillhandahålla SPME-enheter. Life science-verksamheten i Merck fungerar som MilliporeSigma i USA och Kanada. Dessutom vill författarna tacka Thermo Fisher Scientific för tillgång till Q-Exactive Focus orbitrap masspektrometer. Författarna vill tacka Dr Aleksandra Woderska-Jasińska och personalen vid institutionen för transplantationsologi och allmän kirurgi i Bydgoszcz för deras vänliga hjälp i projektet. BB vill tacka prof. Janusz Pawliszyn för möjligheten att provinsamling på Toronto General Hospital under sin vistelse på University of Waterloo.
Acetic acid | Merck | 5330010050 | Mobile phase additive |
Acetonitrile | Alchem | 696-34967-4X2.5L | HPLC solvent |
Ammonium acetate | Merck | 5330040050 | Mobile phase additive |
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER | Benchmark Scientific | BV1010 | Vortex mixer |
Caps | Perlan Technologies | 5183-2076 | Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK |
Chloroform | Merck | 1024441000 | |
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm | Merck | 567570-U | HPLC guard column |
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC column |
Formic acid | Alchem | 497-94318-50ML | Mobile phase additive |
Glass vials | Perlan Technologies | 5182-0714 | |
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC column |
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-AJ0-8328 | HPLC guard column |
Isopropanol | Alchem | 231-AL03262500 | HPLC solvent |
Methanol | Alchem | 696-34966-4X2.5L | HPLC solvent |
Nano-pure water | Merck | 1037281002 | HPLC solvent |
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | Q Exactive Focus | Mass Spectrometer |
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC column |
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Merck | 1504360001 | HPLC guard column |
SPME LC fiber probes, mixed mode | Supelco | prototype fibers | |
UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | UltiMate 3000 | HPLC system |
Vial inserts (deactivated) | Perlan Technologies | 5181-8872 | |
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC column |
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm | Waters | 186007811 | HPLC guard column |