Protokollen præsenterer udnyttelse af den kemiske biopsi tilgang efterfulgt af omfattende metabolomic og lipidomic analyse for kvalitetsvurdering af nyretransplantater afsat til transplantation.
Nyretransplantation er en livreddende behandling for et stort antal mennesker med nyredysfunktion i slutstadiet på verdensplan. Proceduren er forbundet med en øget overlevelsesrate og større kvalitet af patientens liv i forhold til konventionel dialyse. Desværre lider transplantationen af mangel på pålidelige metoder til vurdering af organkvaliteten. Standarddiagnosticeringsteknikker er begrænset til makroskopisk udseendeinspektion eller invasiv vævsbiopsi, som ikke giver omfattende oplysninger om transplantatet. Den foreslåede protokol har til formål at indføre mikroeksistenstræk i fast fase (SPME) som en ideel analysemetode til omfattende metabolomik og lipidomic analyse af alle lavkylære forbindelser, der findes i nyrer, der er afsat til transplantation. SPME-sondens lille størrelse muliggør en kemisk biopsis ydeevne, som muliggør udvinding af metabolitter direkte fra organet uden vævsindsamling. Metodens mindste invasive virkning gør det muligt at udføre flere analyser over tid: direkte efter organhøst, under dens konservering og umiddelbart efter revaskularisering på modtagerens krop. Det er en hypotese, at kombinationen af denne nye prøveudtagningsmetode med et massespektrometer med høj opløsning vil give mulighed for forskelsbehandling af et sæt karakteristiske forbindelser, der kan tjene som biologiske markører for graftkvalitet og indikatorer for mulig udvikling af organdysfunktion.
Ifølge USA’s organindkøbs- og transplantationsnetværk var der 94.756 patienter, der ventede på nyretransplantationer i USA i 2019. i Europa i 2018 var det tal 10.791. Hvert tiende minut, er nogen føjet til den nationale transplantation venteliste i USA, og det anslås, at 20 mennesker dør hver dag venter på en transplantation1,2. Nyretransplantation er en livreddende behandling for et stort antal mennesker, der lider med slutstadiet nyredysfunktion på verdensplan. Proceduren er forbundet med øget overlevelsesrate og større livskvalitet sammenlignet med konventionel dialyse.
Transplantation står imidlertid over for mange alvorlige problemer, såsom organmangel eller mangel på effektive værktøjer til vurdering af organkvaliteten. Standardprotokollerne er begrænset til makroskopisk udseende inspektion eller invasiv vævbiopsi, som ikke giver omfattende oplysninger om kvaliteten af transplantatet. Mens en visuel vurdering giver mulighed for identifikation af tumorer synlige for øjet, anatomiske abnormiteter, eller omfattende skader på transplantater, denne fremgangsmåde er meget subjektiv, varierende i sin effektivitet i henhold til erfaringerne fra observatørerne. Biopsi, på den anden side, kan give værdifulde oplysninger om allerede eksisterende nyresygdomme, og anses derfor for at være en metode til objektiv og dokumenteret værdi i fastsættelsen af graft resultater. Men, biopsi procedure er ikke fri for fejl; der er risiko for potentielle komplikationer såsom blødning og yderligere 4-5 timers prøvepræparat er påkrævet, hvilket i væsentlig grad forlænger den kolde iskæmiske tid. Derfor er brugen af direkte vævsanalyse i Europa begrænset til udvidede kriterier donorer (ECD) og donorer efter kredsløbsdød (DCD)3,4.
Metabolomik og lipidomics er for nylig blevet anerkendt som lovende tilgange til at opnå en bedre forståelse af de ændringer i biokemiske veje, der opstår under organopholdelse. Metabolomic og lipidomic profilering gør det muligt at overvåge systemets umiddelbare reaktioner på pludselige miljømæssige ændringer i forbindelse med fjernelse af organer med efterfølgende konsekvenser: iskæmi, oxidativt stressellerinflammatoriske reaktioner5,6,7,8. Nyrerne er et organ, der i vid udstrækning er forbundet med metaboliske processer, således målinger af metabolitter og lipider koncentrationer kan gøre det muligt at identificere potentielle organkvalitet biomarkører og muliggøre bedre forudsigelser af graft resultat.
I betragtning af ovennævnte komplikationer og begrænsninger i forbindelse med de nuværende organkvalitetsvurderingsmetoder er der behov for en mindre invasiv diagnostisk løsning til hurtig og kompleks vurdering af organkvaliteten. Mikroudtræk i fast fase (SPME) opfylder disse krav som en minimalt invasiv analysemetode, der muliggør dækning af et bredt spektrum af metabolitter og lipider. Teknikken er baseret på indsættelse af en tynd (~200 μm), biokompiselig, titanium-nikkellegeringssonde dækket med en selektiv ekstraktionsfase i det undersøgte organ i en kort periode. Det skal understreges, at SPME forhindrer proteinekstraktion og dermed muliggør metabolismehæmning allerede på indsamlingsstadiet, hvilket er en betydelig fordel i forhold til alternative metoder. Desuden giver miniaturiseringen af anordningen mulighed for udførelse af gentagne og samtidige analyser af få strukturer iorganet 9,10,11.
Evaluering af organkvalitet er fortsat en stor udfordring for læger, som skal træffe hurtige informerede beslutninger om, hvorvidt et givet organ er levedygtigt til transplantation, eller om det skal kasseres. Flere faktorer, såsom donor alder, varigheden af iskæmi, og infektioner og inflammatoriske processer, kan påvirke den langsigtede graft resultat. Mens forskellige metoder er blevet udviklet til dato for at diagnosticere nyre allograft funktion, histopatologisk inspektion forbliver guldstandarden i dennesag 3,4,12. Selv om biopsi procedure kan give betydelige oplysninger om allerede eksisterende donorsygdom og vaskulære ændringer, det er ikke fri for fejl. Stikprøvefejl i forbindelse med interobservervariation og prøveudtagning af utilstrækkelig glomeruli til omfattende oplysninger om organfunktionen er fortsat typiske problemer i denne henseende. Desuden giver præparatet visse spørgsmål såsom en ufuldstændig vurdering af transplantatet i tilfælde af frosne sektioner og forlængelse af proceduretiden for parafling. Men den øgede risiko for blødning, som kan forekomme akut som mikroskopisk eller grov hæmatia, er den største livstruende komplikation forbundet med biopsi procedure. Derfor er antallet af tilladte biopsier strengt begrænset i transplantationsprocedurer, en faktor, der hæmmer erobringen af dynamiske ændringer og tidsserieanalyser via dennemetode 12,13,14. Fordelene ved en histologisk analyse skal afvejes mod de risici, der er forbundet med metoden. Værdien af histologiske fund er ubestridelig, men de forklarer ikke de molekylære mekanismer i afvigelser.
Metabolomics og lipidomics er de yngste domæner af “-omics” videnskabelige familie. Det komplette sæt af lav molekylære (<1.200 Da) humane metabolitter og lipider forbundet inden for et metabolisk netværk er defineret som en human metabolom. Genomet forbliver relativt konstant i hele dets levetid, med mindre ændringer forårsaget af mutationer forekommer sjældent. Metabolomet er et produkt af genekspression, som er meget følsom over for ændringer i alle biologiske processer samt miljømæssige faktorer. Den dynamiske karakter af metabolitter og lipider gør dem perfekte indikatorer for den nuværende organtilstand7,8,15,16. Den SPME-metode, der foreslås i ovennævnte protokol, gør det muligt at opdage ændringer, der forekommer i organet under dets bevarelse, begyndende fra organfjernelse fra donorkroppen indtil revaskularisering hos modtageren. Sondens lille diameter (~200 μm) giver minimal invasiv og giver mulighed for flere prøver fra samme organ uden at forårsage skade på vævet. Gennemførelse af undersøgelser ved hjælp af nyre, som den hyppigst transplanterede organ, giver mulighed for en bedre forståelse og yderligere karakterisering af de metaboliske veje ansvarlig for at afslå kvaliteten og funktionen af transplantater. Muligheden for at overvåge ændringer over tid helt sikkert er en vigtig fordel ved teknikken i forhold til konventionelle invasive metoder såsom biopsi. Den aktuelt fremlagte analyse identificeret ændrede koncentrationer af forskellige grupper af lipider og metabolitter, især af essentielle aminosyrer, puriner, purin nukleosider, og glycerophospholipids. Disse resultater stemmer overens med tidligere vævsanalyserapporter5,6,17,18,19,20. Til dato har de fleste videnskabelige rapporter, der anvender metabolomik eller lipidomics til at forklare processer, der fremkalder komplikationer efter transplantation eller iskæmi/reperfusionsskade (IRI) fænomener, været begrænset til analyse af biofluider21,22,23.
Hver klinisk anvendelse kræver optimering af prøvetagningsprotokollen for at sikre, at analysemetodens ydeevne opfylder de forventede kriterier. I denne forbindelse er fordelen ved at anvende SPME muligheden for at justere betingelserne for forskellige forsøgsdesign. De mange forskellige tilgængelige ekstraktionsfaser giver et bredt spektrum af udtrukne metabolitter med diversificerede polariteter. Samtidig kan dette betragtes som en begrænsning af metoden, da hver sorbent giver selektivitet over for specifikke egenskaber og ikke udvinder alle forbindelser, der findes i prøvematrixen. Det skal bemærkes, at SPME belægninger ekstrakt kun via frie molekyler, og simpelthen ikke interagere med en bundet brøkdel af analysanden. Belægningernes biokompatibilitet medfører ikke toksicitet for vævet, mens ekstraktionen af store molekyler såsom proteiner begrænses; Som følge heraf hæmmes de enzymatiske processer allerede på indsamlingsstadiet, og tilstedeværelsen af artefakter minimeres, hvilket er en stor fordel i forhold til alternative prøveudtagningsmetoder. Belægningens længde påvirker ekstraktionens effektivitet (dvs. belægningens længde angiver overfladearealet og ekstraktionsfasevolumen). således giver længere belægninger højere genindvindinger. På den anden side muliggør kortere belægninger højere rumlig opløsning. For pålidelige resultater, Er det afgørende at nedsænke sonden til nøjagtig samme dybde af nyre cortex. Indsættelse for dybt forårsager risikoen for at komme ind i nyre medulla. Ekstraktionens tid er også proportional med udvindingseffektiviteten. Derfor er udvælgelse af optimal udvindingstid et af de mest kritiske trin i udviklingen af SPME-metoden. Tidsmålingens nøjagtighed giver den højeste repeterbarhed. I biologiske anvendelser som den diskuterede er der altid et kompromis mellem den analytiske protokols følsomhed og repeterbarhed og begrænsningerne i den medicinske procedure. Mens ligevægtsekstraktion giver den højeste følsomhed, anvendes præligereligvildighedsforholdene af sikkerhedsmæssige årsager ofte i sådanne anvendelser, da ekstraktionstiden ikke bør påvirke operationens samlede varighed. Desorptionens effektivitet bestemmes af tidspunktet for processen og sammensætningen af desorptionsopløsningsmidlet, som skal være forenelig med den mobile fase, der anvendes til kromatografisk adskillelse9,10,11.
Et af de vigtigste krav til diagnostisk instrumentering, der anvendes til intrakirurgiske vurderinger, er analysetid. Der gøres aktuelle forsøg på at udvikle et hurtigt værktøj til in vivo SPME-ekstraktion, der er koblet direkte til et massespektrometer via microfluidic open interface (MOI)24 eller coated blade spray (CBS)25. Sådanne tilgange vil gøre det muligt at offentliggøre analytiske resultater i realtid eller tæt på realtid. Anvendelsen af sådanne metoder til analyse af metaboliske og lipidomic-profiler før indgrebet kan forbedre beslutningsprocessen under transplantationsprocedurerne, så den bedst mulige personlige tilgang og hurtig reaktion i tilfælde af organsvigt kan styrkes.
Sammenfattende er det en hypotese, at den foreslåede protokol vil gøre det muligt at opnå fuld metaboliske og lipidomic profiler af nyretransplantater, hvilket igen vil give en omfattende vurdering af organkvalitet og karakterisering af de processer, der er ansvarlige for iskæmi-reperfusion skade. Projektets nyhed omfatter udnyttelse af mikroeksplinter i fast fase (SPME), der tilbyder lav invasiv prøveudtagning af levende systemer i kombination med en af de mest innovative teknologier til metabolomik- og lipidomics-analyse (f.eks. massspektrometeret orbitrap med høj opløsning). SPME kombinerer prøveindsamling, ekstraktion og dæmpning af metabolitter i ét trin, hvilket gør det til et perfekt værktøj til hurtig analyse. Det forventes, at denne protokol vil bidrage til at besvare spørgsmål vedrørende, hvad præ-transplantation betingelser i nyrerne er ansvarlige for forsinket organfunktion eller dens dysfunktioner efter transplantation, samt hvordan graft bevarelse protokol påvirker biokemi af orglet. En sådan viden vil ikke kun have betydelig indvirkning på forebyggelsen af mulige komplikationer i forbindelse med transplantation, men kan bidrage til at forbedre de nuværende graft konserveringsprotokoller, minimere tab af levedygtige transplantationsvæv samt tab af menneskeliv. Den foreslåede løsning vil åbne døren for yderligere undersøgelser på dette område, herunder validering af specifikke potentielle biomarkører og forbedring af terapeutiske resultater i transplantationologien.
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev støttet af tilskud Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 fra National Science Centre. Forfatterne vil gerne anerkende MilliporeSigma, en virksomhed af Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland for at levere SPME-enheder. Mercks life science-virksomhed fungerer som MilliporeSigma i USA og Canada. Også forfatterne ønsker at takke Thermo Fisher Scientific for adgang til Q-Exactive Focus orbitrap massespektrometer. Forfatterne vil gerne takke Dr. Aleksandra Woderska-Jasińska og personalet i Institut for Transplantologi og Generel Kirurgi i Bydgoszcz for deres venlige bistand i projektet. BB vil gerne takke prof. Janusz Pawliszyn for muligheden for prøve indsamling på Toronto General Hospital under hendes ophold på University of Waterloo.
Acetic acid | Merck | 5330010050 | Mobile phase additive |
Acetonitrile | Alchem | 696-34967-4X2.5L | HPLC solvent |
Ammonium acetate | Merck | 5330040050 | Mobile phase additive |
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER | Benchmark Scientific | BV1010 | Vortex mixer |
Caps | Perlan Technologies | 5183-2076 | Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK |
Chloroform | Merck | 1024441000 | |
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm | Merck | 567570-U | HPLC guard column |
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC column |
Formic acid | Alchem | 497-94318-50ML | Mobile phase additive |
Glass vials | Perlan Technologies | 5182-0714 | |
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC column |
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-AJ0-8328 | HPLC guard column |
Isopropanol | Alchem | 231-AL03262500 | HPLC solvent |
Methanol | Alchem | 696-34966-4X2.5L | HPLC solvent |
Nano-pure water | Merck | 1037281002 | HPLC solvent |
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | Q Exactive Focus | Mass Spectrometer |
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC column |
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Merck | 1504360001 | HPLC guard column |
SPME LC fiber probes, mixed mode | Supelco | prototype fibers | |
UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | UltiMate 3000 | HPLC system |
Vial inserts (deactivated) | Perlan Technologies | 5181-8872 | |
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC column |
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm | Waters | 186007811 | HPLC guard column |