Utföra koloskopisk-guidad pinch tarmbiopsier hos möss och utvärdera efterföljande vävnadsförändringar
Summary
Här ger vi en detaljerad beskrivning av proceduren för att inducera colonoscopic-guidad pinch biopsier hos möss och spåra sår stängning i realtid. Dessutom tillhandahålls metoder för beredning av vävnader för histologiska, immunohistokemiska och molekylära analyser av sårbädden.
Abstract
Att förstå de vävnads- och cellförändringar som uppstår i det akuta skadesvaret samt under sårläkningsprocessen är av största vikt när man studerar sjukdomar i mag-tarmkanalen (GI). Den murinkoloniska nypbiopsimodellen är ett användbart verktyg för att definiera dessa processer. Dessutom kan samspelet mellan tarmens luminala innehåll (t.ex. mikrober) och tjocktarmen studeras. Sårinduktion och förmågan att spåra sårstängning över tid på ett tillförlitligt sätt kan dock vara utmanande. Dessutom måste vävnad beredning och orientering utföras på ett standardiserat sätt för att optimalt förhöra histologic och molekylära förändringar. Här presenterar vi en detaljerad metod som beskriver biopsi-inducerad skada och övervakning av sår stängning genom upprepade koloskopier. Ett tillvägagångssätt beskrivs som säkerställer konsekventa och reproducerbara mätningar av sårstorlek, förmågan att samla sårbädden för molekylära analyser samt visualisera sårbädden vid sektionering av vävnader. Förmågan att framgångsrikt utföra dessa tekniker möjliggör studier av akut skada svar, sårläkning och luminal-värd interaktioner inom tjocktarmen.
Introduction
Mag-tarmkanalen (GI) är ett komplext organsystem med tanke på dess flera funktioner, värdcellstyper (t.ex. epitelial, immun, stromal, etc.) samt biljoner mikrober. Mot bakgrund av denna komplexitet innebär sjukdomar i mag-tarmkanalen ofta samspelet mellan alla dessa faktorer. Till exempel är inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD) förknippade med cykler av inflammation och eftergift i MAG-tarmkanalen, vilket innebär aktivering av inflammatoriska celler, dysbios och epitelreparation1,2,3,4,5,6,7. Att ha lämpliga modellsystem för att studera IBD och andra inflammatoriska tillstånd i mag-tarmkanalen är avgörande för att belysa patogenesen vid sjukdom. Flera modeller finns för att studera IBD patogenes inklusive genetiskt konstruerade möss och användning av kemikalier som dextran natriumsulfat (DSS) hos gnagare8,9,10. Begränsningar av dessa modeller inkluderar en oförmåga att exakt kontrollera induktion av inflammation samt svårigheter att utvärdera sårläkning. Alternativa metoder för att efterlikna aspekter av IBD patogenes kan visa sig vara användbara för att utveckla terapier.
Colonoscopic-guidad pinch tarmbiopsier hos möss erbjuder ett användbart modellsystem för att studera patogenesen vid inflammatoriska svaret, sårläkning, liksom värd-mikrob interaktioner i tjocktarmen. Detta tillvägagångssätt användes först som ett experimentellt verktyg 2009, vilket visade dess nytta för att studera det akuta inflammatoriska svaret och sårläkning itarmen 11. Efterföljande studier använde denna teknik för att utvärdera rollerna för olika signalvägar samt tarmfloran, i colonicsårläkning 11,12,13,14,15,16,17,18. Mer nyligen använde vår grupp denna modell för att undersöka vikten av sphingosine-1-fosfat signalering och bakterier i det akuta svaret på colonic skada19. Även om det är användbart, att utföra colonoscopic-guidad nypa tarmbiopsier hos möss och utvärdera efterföljande vävnad förändringar kan vara tekniskt utmanande. Till exempel kan perforering av tarmen uppstå vid induktion av skada och säkerställa konsekventa mätningar av sårbädden genom seriella koloskopier kan vara svårt. Dessutom kan orientering av kolonvävnaden ordentligt för att visualisera sårbädden för histologiska eller immunohistokemiska analyser vara utmanande. Även om viss information finns om dessa metoder18,20, kommer en exakt stegvis beskrivning av dessa tekniker längs visuella hjälpmedel att förbättra tillförlitligheten och bredare nyttan av denna modell. Här presenterar vi en detaljerad metod för att utföra colonoscopic-guidad pinch biopsier hos möss, spåra sår stängning över tiden och förbereda vävnaden för att möjliggöra histologic och molekylära analyser av sårbädden. Att skapa en standardmetod för att utföra dessa tekniker kan utöka användningen av denna modell för att studera tidigare oundervärderade medlare som potentiellt är viktiga för GI-inflammation och sårreparation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att säkerställa konsekventa och exakta tarmbiopsier samt mätningar av sårstorlek är av största vikt när man försöker effektivt utvärdera sårförslutningen i denna modell. Därför bör flera åtgärder vidtas för att vara säkra på att förfarandena genomförs korrekt. För det första får biopsins djup inte vara för grunt eller djupt. Om det är för grunt kommer det inte att finnas ett tillräckligt fönster för att utvärdera sårstängningen. Figur 2 visar ett optimalt bi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från Crohn’s and Colitis Foundation (D.C.M) och New York Crohn’s Foundation (D.C.M. och A.J.D.). Författarna tackar Carmen Ferrara för hjälp med att skapa video ackompanjemang till denna artikel.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
Riferimenti
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
