라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체
Summary
기존의 BODIPY 접합체는 일시성형, 적색 이동 접지 상태 이량체의 착취를 통해 살아있는 세포 단분자 국소화 현미경 검사법(SMLM)에 사용될 수 있습니다. 우리는 나노스코프 길이 척도에서 살아있는 포유류 및 효모 세포에서 세포내 중성 지질과 지방산을 추적하고 해결하기 위해 최적화된 SMLM 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
단 하나 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM) 기술은 전통적인 형광 현미경 검사법의 광학 회절 한계를 극복하고 ~ 20 nm 정밀도로 세포 내 구조 및 생체 분자의 역학을 해결할 수 있습니다. SMLM의 전제 조건은 수천 개의 데이터 수집 프레임에서 포인트 확산 함수의 주공간적 중복을 피하기 위해 어두운 상태에서 형광 상태로 전환하는 형광단입니다. BODIPYs는 기존의 현미경 검사법에 사용되는 수많은 접합체가있는 잘 확립 된 염료입니다. 적색 이동 BODIPY 접지 상태 이량체 (DII)의과도 형성은 밝은 단일 분자 방출을 가능하게하여 단일 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM)을 가능하게합니다. 여기에서 우리는 살아있는 효모 및 포유류 세포에 있는 전통적인 BODIPY 접합체를 가진 SMLM를 위한 간단하 그러나 다재다능한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 초고해상도 이미지를 획득하고 단일 BODIPY-DII 상태를 추적하여 BODIPY 접합체의 주공간 적 정보를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 나노 스코프 길이 규모에서 살아있는 효모 및 포유류 세포에서 지질 방울 (LDs), 지방산 및 리소좀을 해결하기 위해이 절차를 적용합니다. 또한 다른 형광 프로브와 함께 사용할 경우 BODIPY 염료로 멀티 컬러 이미징 기능을 시연합니다. 우리의 대표적인 결과는 보디피 지방산과 효모의 중성 지질의 차등 공간 분포 와 이동성을 보여줍니다. SMLM에 대한 이 최적화된 프로토콜은 수백 개의 상용 BODIPY 접합체와 함께 사용할 수 있으며 이 작업의 적용을 훨씬 뛰어넘는 나노 스케일에서 생물학적 공정을 연구하는 데 유용한 리소스입니다.
Introduction
단 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM) 스토크 광학 재건 현미경 검사법 (STORM) 및 광 활성화 국소화 현미경 검사법 (PALM)과 같은 기술은 아베의 광학 회절 한계1,,2 및 단일 생체 분자의 역학을 추적하기위한 정보로 초고해상도 이미지를 생성하는 방법으로등장3,,4. SMLM과 호환되는 프로브에 대한 요구 사항 중 하나는 포인트 확산 함수(PSF)의 공간 중복을 피하기 위해 언제든지 활성 형광단의 수를 제어하는 기능입니다. 각각의 데이터 수집 프레임에서 각 형광형광단의 위치는 해당 포인트 확산 함수를 피팅하여 ~20nm 정밀도로 결정됩니다. 전통적으로, 형광의 온-오프 깜박임은 위성 광 전환1,2,2,5 또는 화학적으로 유도된 본질적인 깜박임6을통해 제어되었습니다. 다른 접근법은 불소-활성화 단백질7,,8 및 프로그램가능한 결합-전체 내부 반사 형광(TIRF) 또는 광 시트여기(lightsheet) 9에 표지된 DNA 올리고머의 과도 결합시 플루오로겐의 유도된 활성화를 포함한다. 최근, 우리는 SMLM10에 대한 신규하고 다재다능한 라벨링 전략을 보고했는데, 이는 기존의 붕소 디파이메탄(BODIPY) 컨쥬게이트11,,12,,13의 적색 시프트 디메나메(DII)상태를 보고하고 적색 이동 파장에서 특이적으로 흥분되고 검출된다.
BODIPYs는 특히 하위 세포 구획 및 생체 분자14,,15,,16을라벨 변이체의 수백 염료널리 사용된다. 살아있는 세포에 있는 사용의 용이성과 적용성 때문에, BODIPY 이체는 전통적인 형광 현미경 검사법에 대해 상업적으로 유효합니다. 여기서는 상용 BODIPY 컨쥬게이트 수백 개에 대한 상세하고 최적화된 프로토콜을 라이브 셀 SMLM에 사용할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. BODIPY 단량체의 농도를 조정하고 여기 레이저 파워, 이미징 및 데이터 분석 매개 변수를 최적화하여 고품질 의 초고해상도 이미지 및 단일 분자 추적 데이터를 살아있는 세포에서 얻을 수 있습니다. 저농도(25-100 nM)에서 사용될 경우, BODIPY 접합체는 적색 시프트 채널에서 SMLM과 종래의 종래형 형광 현미경 검사법에 대해 동시에 사용될 수 있다. 얻어진 단일 분자 데이터는 움직이지 않는 구조의 공간 조직을 정량화하고 살아있는세포(17)에서분자의 확산 상태를 추출하기 위해 분석될 수 있다. 녹색 및 빨간색 형태의 BODIPY 프로브의 가용성은 다른 호환 형광단과 올바른 조합으로 사용될 때 다색 이미징을 허용합니다.
이 보고서에서는 BODIPY-C12,BODIPY(493/503), BODIPY-C12 빨간색 및 리소트래커-그린을 사용하여 라이브 셀 SMLM 데이터를 여러 색상으로 획득하고 분석하기 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 지방산과 중성 지질을 ~ 30 nm 해상도로 해결합니다. 우리는 또한 효모 세포가 그들의 신진 대사 상태에 따라 외부적으로 추가된 지방산의 공간 분포를 조절한다는 것을 더 보여줍니다. 우리는 BODIPY-fatacids (FA)를 추가한 것이 먹이 조건 하에서 산상성 망상 (ER) 및 지질 방울 (LDs)에 국한되는 반면 BODIPY-FA는 단식 시 플라즈마 막에 비 LD 클러스터를 형성한다는 것을 발견했습니다. 우리는 살아있는 포유류 세포에 있는 리소좀 및 LDs를 심상하기 위하여 이 기술의 응용을 더 확장합니다. 기존의 BODIPY 접합체를 사용하는 SMLM에 대한 당사의 최적화된 프로토콜은 무수히 많은 BODIPY 접합체를 사용하여 나노 스케일에서 생물학적 공정을 연구하는 데 유용한 리소스가 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는 기존의 BODIPY 접합체를 사용하여 공간 해상도가 상당히 개선된 SMLM 이미지를 얻는 방법을 시연했습니다. 이 방법은 이중 분자 만남을 통해 일시적으로 형성되는 기존의 BODIPY 염료의 이전에 보고된 적색 이동 DII 상태를 악용하는 것을 기반으로 합니다. 이러한 상태는 특히 흥분 하고 적색 이동 파장으로 감지 될 수 있으며 SMLM에 대 한 충분히 희소 하 고 수명이 짧은. 레이…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 R21GM127965의 밑에 건강의 국가 학회의 일반 의학의 국가 학회에 의해 지원되었습니다.
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
Riferimenti
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