גישה סטריאו-טיאו-טסטרואקטיבית מסתגלת לטכניקות רב-תכליתיות במדעי המוח
Summary
המתואר כאן הוא הליך סטריאוטקטי שיכול למקד אזורים מאתגרים וקשים להשכה למוח (בשל מגבלות מרחביות) באמצעות גישה קורונטית זוויתית. פרוטוקול זה מותאם הן למודלים של עכברים והן למודלים של חולדות וניתן ליישם אותו על יישומים מוחיים מגוונים, כולל השתלת צינורית ומיקרו-נג’קציה של מבנים ויראליים.
Abstract
ניתוח סטריאוטקטי הוא כלי חיוני במעבדה המודרנית למדעי המוח. עם זאת, היכולת למקד במדויק ומדויק אזורים במוח קשה להגיע עדיין מציב אתגר, במיוחד בעת מיקוד מבני המוח לאורך קו האמצע. אתגרים אלה כוללים הימנעות של סינוס קשת מעולה החדר השלישי ואת היכולת למקד באופן עקבי גרעיני מוח סלקטיביים ודיסקרטיים. בנוסף, טכניקות מתקדמות יותר במדעי המוח (למשל, אופטוגנטיקה, פוטומטריית סיבים והדמיה של שני פוטונים) מסתמכות על השתלה ממוקדת של חומרה משמעותית למוח, ומגבלות מרחביות הן מכשול נפוץ. מוצג כאן פרוטוקול ניתן לשינוי למיקוד סטריאוטקטי של מבני מוח מכרסמים באמצעות גישה קורונית זוויתית. זה יכול להיות מותאם 1) מודלים עכבר או חולדה, 2) טכניקות שונות במדעי המוח, ו 3) אזורי מוח מרובים. כדוגמה מייצגת, הוא כולל את החישוב של קואורדינטות סטריאוטקטיות למיקוד של גרעין ההונאה ההיפותלמוסית של העכבר (VMN) לניסוי עיכוב אופטוגנטי. הליך זה מתחיל במיקרו-רינג’ק דו-צדדי של וירוס הקשור לאדנו (AAV) המקודד ערוץ כלוריד רגיש לאור (SwiChR++) למודל עכבר תלוי Cre, ואחריו ההשתלה הדו-צדדית הזוויתית של צינורית fiberoptic. באמצעות גישה זו, הממצאים מראים כי הפעלה של תת קבוצה של נוירונים VMN נדרש עבור תגובות נגד פיקוח גלוקוז שלם היפוגליקמיה המושרה אינסולין.
Introduction
שליטה עצבית בהתנהגות, האכלה ומטבוליזם כרוכה בתיאום של נוירו-מעגלים מורכבים, אינטגרטיביים ומיותרים. מטרת הנהיגה של תחום מדעי המוח היא לנתח את הקשר בין מבנה המעגל העצבי לתפקוד. למרות שכלי מדעי המוח הקלאסיים (כלומר, נגעים, זריקות פרמקולוגיות מקומיות וגירוי חשמלי) חשפו ידע חיוני לגבי תפקידם של אזורי מוח ספציפיים השולטים בהתנהגות ובמטבוליזם, כלים אלה מוגבלים על ידי חוסר הספציפיות וההיפוךשלהם 1.
ההתקדמות האחרונה בתחום מדעי המוח שיפרה מאוד את היכולת לחקור ולתפעל את תפקוד המעגל באופן ספציפי מסוג תא עם רזולוציה ספאטיוטמפוראלית גבוהה. 2 אופטוגנטית ו כימיה3 גישות, למשל, לאפשר מניפולציה מהירה והפיכוי של פעילות בסוגי תאים מוגדרים גנטית של בעלי חיים נעים בחופשיות. אופטוגנטיקה כרוכה בשימוש בערוצי יונים רגישים לאור, המכונים channelrhodopsins, כדי לשלוט בפעילות העצבית. המפתח לטכניקה זו הוא אספקת הגנים של channelrhodopsin ומקור אור כדי להפעיל את opsin. אסטרטגיה נפוצה להעברת גנים היא באמצעות שילוב של 1) עכברים מהונדסים גנטית המביעים Cre-רקומבינאז בנוירונים נפרדים, ו -2) וקטורים ויראליים תלויי Cre קידוד channelrhodopsin.
בעוד שאופטוגנטיקה מספקת אמצעים אלגנטיים ומדויקים ביותר לשליטה בפעילות העצבית, השיטה מותנית במיקרו-ערך סטריאוטקטי מוצלח של וקטור ויראלי ומיקום סיבים לאזור מוח מוגדר. למרות הליכים סטראוטקטיים הם דבר שבשגרה במעבדה המודרנית למדעי המוח (ויש כמה פרוטוקולים מצוינים המתארים הליך זה)4,5,6, היכולת למקד באופן עקבי ורבייה אזורי מוח נפרדים לאורך קו האמצע (כלומר, ההיפותלמוס הבינוני, אזור במוח קריטי לרגולציה של פונקציות הומיאוסטטיות7) מציג אתגרים נוספים. אתגרים אלה כוללים הימנעות של סינוס קשת מעולה, החדר השלישי, גרעין היפותלמי סמוך. בנוסף, ישנן מגבלות מרחביות משמעותיות להשתלה דו-צדדית של חומרה הנדרשת למחקרי עיכוב. עם אתגרים אלה בחשבון, פרוטוקול זה מציג הליך ניתן לשינוי למיקוד אזורי מוח נפרדים באמצעות גישה סטריאואטקטית זוויתית.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההתקדמות האחרונה במדעי המוח תמכה בתובנה והבנה מתקדמות לגבי הפעילות והתפקוד של מדעי המוח. זה כולל את היישום של טכנולוגיות אופטוגנטיות וכימוגנטיות כדי להפעיל או להשתיק אוכלוסיות עצביות נפרדות ואתרי ההקרנה שלהם ב vivo. לאחרונה, זה כלל התפתחות של אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית (למשל, GCaMP, RCaMP) ו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK) מעניק F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), פרס מדע בסיסי חדשני של האגודה האמריקאית לסוכרת (#1-19-IBS-192 ל-G.J.M.) ולמרכז לחקר השמנת יתר תזונתית במימון NIDDK (DK-035816), מרכז לחקר הסוכרת (DK-017047) וסוכרת, השמנת יתר ומטבוליזם אימון מענק T32 DK0007247 (T.H.M) באוניברסיטת וושינגטון.
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
Riferimenti
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
- Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
- Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
- McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
- Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
- Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
- Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
- Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
- Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
- Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).
