Summary

Axonal Transport av organeller i motorneuronkulturer ved hjelp av mikrofluidiske kamre system

Published: May 05, 2020
doi:

Summary

Axonal transport er en avgjørende mekanisme for motor neuron helse. I denne protokollen gir vi en detaljert metode for sporing av aksonaltransport av sure rom og mitokondrier i motorneuronaksoner ved hjelp av mikrofluidiske kamre.

Abstract

Motorneuroner (MN) er svært polariserte celler med svært lange aksoner. Axonal transport er en avgjørende mekanisme for MN helse, bidrar til nevronal vekst, utvikling, og overlevelse. Vi beskriver en detaljert metode for bruk av mikrofluidiske kamre (MfCer) for sporing av aksonal transport av fluorescerende merkede organeller i MN-aksoner. Denne metoden er rask, relativt billig, og gjør det mulig å overvåke intracellulære signaler i rom og tid. Vi beskriver en trinnvis protokoll for: 1) Fabrikasjon av polydimethylsiloxane (PDMS) MfCer; 2) Plating av ventral ryggmarg eksplanter og MN dissosiert kultur i MfCer; 3) Merking av mitokondrier og sure rom etterfulgt av live confocal imagining; 4) Manuell og halvautomatisk aksonal transportanalyse. Til slutt viser vi en forskjell i transport av mitokondrier og sure rom av HB9::GFP ventral ryggmargutplante aksoner som et bevis på systemets gyldighet. Til sammen gir denne protokollen et effektivt verktøy for å studere aksonaltransport av ulike aksonale komponenter, samt en forenklet håndbok for MFC-bruk for å bidra til å oppdage romlige eksperimentelle muligheter.

Introduction

MN er svært polariserte celler med lange aksoner, og når opptil en meter lang hos voksne mennesker. Dette fenomenet skaper en kritisk utfordring for vedlikehold av MN-tilkobling og funksjon. Følgelig er MN-er avhengige av riktig transport av informasjon, organeller og materialer langs aksonene fra cellekroppen til synapse og tilbake. Ulike cellulære komponenter, som proteiner, RNA og organeller blir transportert regelmessig gjennom aksonene. Mitokondrier er viktige organeller som rutinemessig transporteres i MN. Mitokondrier er avgjørende for riktig aktivitet og funksjon av MN, ansvarlig for ATP-bestemmelse, kalsiumbufring og signalprosesser1,2. Aksonaltransport en mitokondrier er en godt studert prosess3,4. Interessant, feil i mitokondrietransport ble rapportert å være involvert i flere nevrodegenerative sykdommer og spesielt i MN sykdommer5. Sure rom tjener som et annet eksempel for iboende organeller som beveger seg langs MN-aksoner. Sure rom inkluderer lysosomer, endosomer, trans-Golgi apparat, og visse sekretoriske vesikler6. Defekter i aksonal transport av sure rom ble funnet i flere nevrodegenerative sykdommer samt7, og nyere papirer fremhever deres betydning i MN sykdommer8.

For å effektivt studere aksonal transport, mikrofluidiske kamre som skiller somatiske og aksonale rom er ofte brukt9,,10. De to betydelige fordelene med det mikrofluidiske systemet, og compartmentalization og isolering av aksoner, gjør det ideelt for studiet av subcellulære prosesser11. Den romlige separasjonen mellom nevronale cellelegemer og aksoner kan brukes til å manipulere de ekstracellulære miljøene i forskjellige nevronale rom (f.eks. aksoner vs. soma). Biokjemisk, nevronal vekst/degenerasjon, og immunofluorescens analyser er alle fordeler fra denne plattformen. MfCer kan også hjelpe til med å studere celle-til-celle-kommunikasjon ved å coculturing nevroner med andre celletyper, for eksempel skjelettmuskler12,,13,14.

Her beskriver vi en enkel, men presis protokoll for overvåking av mitokondrier og sur romtransport i motornevroner. Vi viser videre bruken av denne metoden ved å sammenligne den relative prosentandelen av retrograd og anterograde bevegelige organeller, samt fordelingen av transporthastighet.

Protocol

Omsorg og behandling av dyr i denne protokollen ble utført under tilsyn og godkjenning av Tel Aviv University Committee for Animal Ethics. 1. MFC forberedelse PDMS støping i primære former (Figur 1) Kjøp eller opprett primære former (wafers) etter en detaljert protokoll9. Bruk trykkluft for å fjerne alle typer smuss fra wafer-plattformen før du går videre til beleggtrinnet. Overflaten av wafers bør se g…

Representative Results

Etter den beskrevne protokollen ble musembryonale HB9::GFP ryggmargsutplanter dyrket i MFC (Figur 4A). Explants ble dyrket i 7 dager, da aksoner fullt krysset inn i det distale rommet. Mitotracker Deep Red og Lysotracker Red fargestoffer ble lagt til distale og proksimale rom for å merke mitokondrier og sure rom (Figur 4C). Axons i distale spor ble avbildet, og filmene ble analysert som følger:…

Discussion

I denne protokollen beskriver vi et system for å spore aksonal transport av mitokondrier og sure rom i motoriske nevroner. Denne forenklede in vitro-plattformen tillater nøyaktig kontroll, overvåking og manipulering av subcellulære nevronale rom, noe som muliggjør eksperimentell analyse av motorneuron lokale funksjoner. Denne protokollen kan være nyttig for å studere MN sykdommer som ALS, for å fokusere på å forstå den underliggende mekanismen for aksonal transport dysfunksjon i sykdommen10</…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Israel Science foundation (ISF, 561/11) og Det europeiske forskningsrådet (ERC, 309377).

Materials

35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software – version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium – Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

Riferimenti

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).
check_url/it/60993?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

View Video