Il trasporto assonale è un meccanismo cruciale per la salute dei motoneuroni. In questo protocollo forniamo un metodo dettagliato per tracciare il trasporto assonale di compartimenti acidi e mitocondri negli assoni dei motoneuroni utilizzando camere microfluidiche.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Trasporto assonale di Organanelle nelle colture del motoneurone utilizzando il sistema di camere microfluidiche
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I motoneuroni (MN) sono cellule altamente polarizzate con assoni molto lunghi. Il trasporto assonale è un meccanismo cruciale per la salute di MN, contribuendo alla crescita neuronale, allo sviluppo e alla sopravvivenza. Descriviamo un metodo dettagliato per l'uso di camere microfluidiche (MFC) per il monitoraggio del trasporto assonale di organelli etichettati fluorescenti negli assoni MN. Questo metodo è rapido, relativamente poco costoso, e consente il monitoraggio di segnali intracellulari nello spazio e nel tempo. Descriviamo un protocollo passo dopo passo per: 1) Fabbricazione di MFC polidimetilsiloxane (PDMS); 2) placcatura degli esanti del midollo spinale ventrale e coltura dissociata MN nelle MFC; 3) Etichettatura dei mitocondri e dei compartimenti acidi seguita dall'immaginazione confocale viva; 4) Analisi manuale e semiautomatica del trasporto assonale. Infine, dimostriamo una differenza nel trasporto di mitocondri e compartimenti acidi di HB9::GFP del midollo spinale ventrale degli assoni explant come prova della validità del sistema. Complessivamente, questo protocollo fornisce uno strumento efficiente per studiare il trasporto assonale di vari componenti assonali, nonché un manuale semplificato per l'utilizzo di MFC per aiutare a scoprire le possibilità spaziali sperimentali.
Introduzione
Le MN sono cellule altamente polarizzate con lunghi assoni, che raggiungono fino a un metro di lunghezza negli esseri umani adulti. Questo fenomeno crea una sfida critica per il mantenimento della connettività e della funzione MN. Di conseguenza, le MN dipendono da un corretto trasporto di informazioni, organelli e materiali lungo gli assoni dal loro corpo cellulare alla sinapsi e alla schiena. Vari componenti cellulari, come proteine, RNA e organelli, vengono trasportati regolarmente attraverso gli assoni. I mitocondri sono organelli importanti che vengono regolarmente trasportati in MN. I mitocondri sono essenziali per la corretta attività e funzione delle MN, respo....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
La cura e il trattamento degli animali in questo protocollo sono stati eseguiti sotto la supervisione e l'approvazione del Comitato universitario di Tel Aviv per l'etica animale.
1. Preparazione MFC
- Fusione PDMS negli stampi primari (Figura 1)
- Acquistare o creare stampi primari (wafer) seguendo un protocollo dettagliato9.
- Utilizzare l'aria pressurizzata per rimuovere qualsiasi tipo di sporco dalla piattaforma wafer prima di procedere alla fase di rivestimento. La superficie dei wafer dovrebbe apparire liscia e chiara.
- Riempire un contenitore con 50....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Seguendo il protocollo descritto, gli espiantati embrionali HB9::GFP del midollo spinale sono stati coltivati in MFC (Figura 4A). Gli espiantati sono stati coltivati per 7 giorni, quando gli assoni sono stati completamente attraversati nel vano distale. Mitotracker Deep Red e Lysotracker Coloranti rossi sono stati aggiunti ai compartimenti distale e prossimali al fine di etichettare i mitocondri e scomparti acidi (Figura .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questo protocollo, descriviamo un sistema per monitorare il trasporto assonale di mitocondri e compartimenti acidi nei motoneuroni. Questa piattaforma in vitro semplificata consente un controllo preciso, il monitoraggio e la manipolazione dei compartimenti neuronali subcellulari, consentendo l'analisi sperimentale delle funzioni locali dei motoneuroni. Questo protocollo può essere utile per studiare malattie MN come la SLA, per concentrarsi sulla comprensione del meccanismo sottostante di disfunzione del trasporto ass.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Israel Science foundation (ISF, 561/11) e del Consiglio europeo della ricerca (ERC, 309377).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 35mm Fluodish – piatto con fondo in vetro | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – piatto con fondo in vetro | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (citosina β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock di 2mM in filtrato DDW |
| B-27 Integratore (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Diluire a 10 µ g/mL in ddw filtrato con 0,01% BSA)Punzone |
| biopsia da 1,25 mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | Per la preparazione di un punzone per biopsia MFC di grandi dimensioni |
| da 6 mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | Per la preparazione di un piccolo |
| punzone per biopsia | World Precision Instruments WPI | 504534 | Per la preparazione di un grande |
| MFC Bitplane Software Imaris - versione 8.4.1 | Imaris | ||
| Albumina di siero bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% p/v in ddw |
| Clorotrimetilsilano | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Diluire a 10 &; g/mL in ddw filtrato con 0,01% BSA) |
| Gradiente di densità Medium - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deossiribonucleasi I (DNAsi) da pancreas bovino | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasale |
| Dow Corning Grasso siliconico ad alto vuoto | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | Per la preparazione di stampi epossidici |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | Diluire 1:10 in DDW |
| Pinze fini Dumont #55 0,05 & volte; 0,02 mm | FST | ||
| Indurente epossidico | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | Per la preparazione di stampi epossidici |
| Resina epossidica | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | Per la preparazione di stampi epossidici |
| Software FIJI | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Diluire a 10 &; g/mL in ddw filtrato con 0,01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP ceppo di topi | Jackson Laboratories Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Diluire 1:10 in ddw con l'aggiunta dell'1% P/S e filtro |
| iQ software | Andor | ||
| Iris forbici, curve, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Forbici per iride, dritte, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Mezzo neurobasale | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscopio | Nikon | ||
| Penicillina-Streptomicina (P/S) Soluzione | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poli-L-Ornitina (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Diluire 1:1000 in kit di elastomero siliconico flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Tripsina da pancreas bovino | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg / mL in 1XPBS |
| Vannas molle forbici di microdissezione, lama da 3 mm | FST | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
Riferimenti
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neu....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
