血管化、拡張開発、および顕微鏡イメージングの改善のための腎オルガノイドおよびオルガノイド培養の最適化
Summary
この研究は、臓器の発達を研究するための2つの方法、培養胚器官およびオルガノイドの血管化を可能にする鳥類胚からの絨毛球膜(CAM)の改善された異種移植セットアップと、新しい固定z方向を説明する。高解像時間経過共焦点イメージングを可能にする改変実験条件を有する臓器培養法。
Abstract
胚性腎臓の有機的培養、特に多能性幹細胞由来の腎臓オルガノイドは、発達過程および腎臓病のモデリングに優れたツールである。しかし、モデルは血管化と機能性の欠如によって制限されています。これに対処するために、血液の血管化と回復を得るために鳥の胚の絨毛管内膜(CAM)に細胞および組織を異種移植する方法のための改良されたプロトコルが開発された。移植片はCAMにサンプルを固定し、乾燥から移植片を保護する培養媒体とそれらを供給するカスタムメイドのミニ貯蔵所と重ねられる。改善された培養法により、異種移植片は最大9日間増殖する。また、この原稿は、以前に発表された固定Z方向(FiZD)法を用いて、腎オルガノイドおよび有機的培養物の長期的な共焦点イメージングに最適な条件を提供する方法についても説明しています。この方法は、ガラスカバースリップと膜の間の胚器官またはオルガノイドを大量の媒体で穏やかに圧縮し、最大12日間のイメージングに優れた条件を提供します。これらの方法は、共焦点イメージングを改善した腎オルガノイドおよび有機的な腎臓培養物への血管化および血流を可能にする。ここに記載されている方法は、腎臓ex vivoの基本的および応用機能を研究するために非常に有益である。どちらの方法も、様々なタイプの組織やオルガノイドに適用可能です。
Introduction
胚性腎臓のオルガノーチ培養は、数十年前2、2、3年前に腎生年月1日を研究する重要なモデルとなった。,3腎オルガノイドは、健康で病気の腎臓の発達を研究するための高度なモデルシステムを表す4.しかし、両方の方法の主な欠点は、どちらの方法も腎臓の主な機能である血液濾過を再現していないということです。腎血管系と腎血管系は、生体内開発の初期段階と同様に、腎オルガノイドおよび有機的培養で発達する。しかし、体外で形成された糸球体は血管5のままである。元生体胚性腎臓および腎組織性の血管化は、インビボ条件下でのみ移植実験において以前に実証された。例えば、マウス腎臓カプセルの下でヒト多能性幹細胞由来の腎オルガノイドを移植することにより、機能ステージ6へのオルガノイド中のネフロンの開発が可能になる。
純粋にインビトロ培養と生体内移植方法の中間的アプローチは、鳥類胚のCAMへの異種移植である。インタクトマウス腎臓原始の血管化は、このシステム77,88を用いて以前に実証されている。しかしながら、異種移植されたマウス腎臓における腎脈管系は、移植片9ではなく宿主内皮由来であったことも示された。この観察は、ドナー由来の内皮細胞の生存のために実験条件が非透過性であったため、胚性腎臓のキメラ(鳥類哺乳類)モデルの可能性を著しく低下させ、腎臓血管系の発達を研究した。
このプロトコルの最初の部分で提示された鳥卵のCAM上のマウス胚性腎臓の培養のための改善された方法である、organotypic培養と異種移植の微小環境条件を組み合わせた。以前の方法の主な改善は、マウスの胚性腎臓と腎オルガノイドをCAMに直接置く代わりに、移植領域が移植された組織を供給する培養培地で満たされた透過性ミニリザーバーで重ね合せることである栄養素を使用し、乾燥から保護します。実験の成功率は大幅に増加し、ドナー由来血管系の発達条件は改善する。この方法を異種移植培養物に適用すると、ドナー腎臓からの内因性内皮細胞から構成される糸球体血管系の発達が生じる。
細胞形態形成の詳細な分析は、腎臓培養モデルのもう一つの重要なアプリケーションです。腎臓培養のタイムラプス画像取得の以前に報告された方法は、胚性腎臓の全体的な形態およびパターニングの分析にのみ十分であるが、個々の細胞10を追跡するためのものではない。近年、腎オルガノイドとオルガノピック培養物の高解像度共焦点共焦点3Dタイムラプスイメージングを目的とした新規固定Z方向(FiZD)法が11に記載された。この方法では、オルガノイドと胚器官は、サンプルの厚さが70μmに達するまで、カスタム設計プレート内のガラスカバースリップと透過性のトランスウェルインサートの透過膜の間で穏やかに圧縮され、イメージングに最適な光学条件を提供します。方法の第2部では、カスタム設計プレートの製造と長期オルガノイドイメージングのためのFiZD実験の設定のための詳細なプロトコルが記載されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
古典的な腎性素培養法を改良し、血管化、拡張開発、および最適4D(すなわち、3D画像および時間)ex vivo胚性腎臓およびオルガノイドのイメージングを可能にする2つの詳細なプロトコルが提示される。このセクションでは、この方法の重要な手順を説明し、トラブルシューティングについて説明します。
他のCAM培養法とこの改良された鶏CAM培養法との有意な違いは、CAMへの…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、スオメン・アカテミア(フィンランドアカデミー)(206038、121647、250900、260056)によって財政的に支援されました。センター・オブ・エクセレンス助成金2012-2017 251314、ムヌアイサテオ – フィンランド腎臓肝臓協会、シグリッド・ジュセリュクセン・セーティオ、ビクトリアスティフテルセン、フィンランドのスウェーデン文化財団、 ノボノルディスク、シェーパヤイェシュト(フィンランド癌学会)、欧州共同体第7枠組みプログラム(FP7/2007-2013;FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608)、H2020マリー・スクロスカ・キュリー・アクション・トレーニング・イノヴェーティナル・ネットワーク「RETRACT3著者らはポーラ・ハイプス、ヨハンナ・ケコラハティ=リヤス、ハンネレ・ヘルクマンの技術支援に感謝している。
図3、4、映画2は開発の許可を得て復刻される。
Materials
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
Riferimenti
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. . Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Biologia dello sviluppo. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
