Optimalisering av renal organoid og organotypisk kultur for vaskularisering, utvidet utvikling og forbedret mikroskopiavbildning

Summary

Dette arbeidet beskriver to metoder for å studere organutvikling, et forbedret xenotransplantasjonsoppsett på chorioallantoic membran (CAM) fra fugleembryoer som gjør det mulig for vaskularisering av kultiverte embryonale organer og organoider og en ny fast z-retning organkulturmetode med modifiserte eksperimentelle forhold som gjør det mulig å høyoppløsnings tidsforløp konfokal avbildning.

Abstract

Embryonale nyreorganotypic kulturer, og spesielt pluripotent stamcelle-avledet nyre organoider, er gode verktøy for å følge utviklingsprosesser og modellering nyresykdom. Modellene er imidlertid begrenset av mangel på vaskularisering og funksjonalitet. For å løse dette ble det utviklet en forbedret protokoll for metoden for xenograftingceller og vev til chorioallantoic membranen (CAM) av et fugleembryo for å få vaskularisering og restaurering av blodstrømmen. Grafts er overlaid med skreddersydde minireservoarer som fikser prøvene til CAM og forsyner dem med kulturmedium som beskytter grafts fra tørking. Den forbedrede kulturmetoden gjør det mulig for xenografts å vokse i opptil 9 dager. Manuskriptet beskriver også hvordan man kan gi optimale forhold for langsiktig konfokal avbildning av nyreorganoider og organotypic kulturer ved hjelp av den tidligere publiserte Fixed Z-Direction (FiZD) metoden. Denne metoden komprimerer forsiktig et embryonisk organ eller organoid mellom en glasscoverslip og membran i en stor mengde medium og gir gode forhold for avbildning i opptil 12 dager. Sammen tillater disse metodene vaskularisering og blodstrøm til nyreorganoider og organotypic nyrekulturer med forbedret konfokal avbildning. Metodene som er beskrevet her er svært gunstige for å studere grunnleggende og anvendte funksjoner av nyrer ex vivo. Begge metodene gjelder for ulike typer vev og organoider.

Introduction

Organotypic kultur av embryonale nyrer ble en viktig modell for å studere nefrogenesis tiår siden^1,2,3. Nyreorganoider representerer et avansert modellsystem for å studere utvikling av friske og syke nyrer⁴. Den viktigste ulempen for begge metodene er imidlertid at ingen av metodene rekapitulerer nyrens hovedfunksjon: blodfiltrering. Nephrons og nyrevaskulatur utvikler seg i nyreorganoider og organotypic kulturer på samme måte som tidlig stadium in vivo utvikling; Imidlertid forblir glomeruli dannet in vitro avaskulær⁵. Vaskelse av ex vivo embryonale nyrer og nyreorganoider ble tidligere vist i transplantasjonseksperimenter bare under in vivo-forhold. For eksempel tillater transplantasjon av humane pluripotente stamcelleavledede nyreorganoider under en musnyrekapsel utvikling av nefronene i organoiden til et funksjonelt stadium⁶.

En mellomliggende tilnærming mellom rent in vitro kulturer og in vivo transplantasjon metoder er xenotransplantasjon til CAM av fugleembryoer. Vascularization av intakt mus nyre primordia har blitt vist tidligere ved hjelp av dette systemet^7,8. Det ble imidlertid også vist at nyrevaskulaturen i xenotransplantert murine nyre ble avledet fra verten endotelet, ikke graft⁹. Denne observasjonen reduserte signifikant potensialet til kimeiske (fugle-pattedyr) modeller av embryonal nyre for å studere utvikling av nyrevaskulaturen, fordi de eksperimentelle forholdene var ikke tillatte for overlevelsen av donor-avledede endotelceller.

Presentert i den første delen av denne protokollen er en forbedret metode for dyrking av mus embryonale nyrer på CAM av fugleegg, kombinere mikromiljøforhold av organotypic kultur og xenotransplantasjon. Den viktigste forbedringen til tidligere metoder er at i stedet for å plassere musen embryonale nyrer og nyreorganoider direkte på CAM, implantasjonområdet er overlaid med gjennomtrengelige minireservoarer fylt med kultur medium som leverer transplantert vev med næringsstoffer og beskytte den mot tørking. Suksessraten for forsøkene øker betydelig og betingelsene for utvikling av donor-avledet vaskulatur forbedres. Anvendelse av denne metoden til xenotransplant kulturer resulterer i utvikling av glomerulær vaskulatur består av endogene endotelceller fra donor nyrer.

Detaljert analyse av cellulær morfodinese er en annen viktig anvendelse av nyrekulturmodeller. Tidligere rapporterte metoder for tidsforløp bilde oppkjøp av nyrekulturer er tilstrekkelig bare for analyse av generell morfologi og mønster av embryonalnyre, men ikke for å spore individuelle celler¹⁰. Nylig ble en ny Fixed Z-Direction (FiZD) metode rettet mot høyoppløselig konfokal 3D-tidsforløpsavbildning av nyreorganoider og organotypic kulturer beskrevet¹¹. I denne metoden komprimeres organoider og embryonale organer forsiktig mellom en glasscoverslip og en gjennomtrengelig membran av en transwell-innsats i en spesialdesignet plate til tykkelsen på prøven når 70 μm, noe som gir optimale optiske forhold for bildebehandling. I den andre delen av metodene er en detaljert protokoll for fabrikasjon av en spesialdesignet plate og oppsett av FiZD-eksperimenter for langsiktig organoid avbildning beskrevet.

Protocol

Dyrepleie og prosedyrer var i samsvar med finsk nasjonal lovgivning for bruk av laboratoriedyr, Den europeiske konvensjon om beskyttelse av virveldyr dyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål (ETS 123), og EU-direktiv86/609/EØF. 1. Fabrikasjon av minireservoarer for dyrking av mus embryonale nyrer og nyreorganoider på kylling CAM og sette opp xenotransplantering eksperimenter Bruk transwell celle kultur innsatser designet for 6 brønn eller 12 brønnplater….

Representative Results

CAM kultur protokollen presentert her aktivert svært effektiv vaskularisering av nyreorganoider og embryonale nyrer som følge av xenotransplantasjon på kylling CAM (Figur 1, Movie 1). Minireservoarer som inneholder kulturmedium leverte næringsstoffer til donorvev og beskyttet det mot tørking i tidsperioden før riktig vaskularisering. Denne metoden ga tillatte forhold for donor-avledede endotelceller å vokse. Derfor var nyrevaskulatur i transplanterte nyrer og organoid…

Discussion

To detaljerte protokoller presenteres som avgrense den klassiske renal organotypic kultur metoden, og aktivere vaskularisering, utvidet utvikling, og optimal 4D (dvs. 3D bilde og tid) avbildning av ex vivo embryonale nyrer og organoider. Denne delen fremhever de kritiske trinnene i metodene og diskuterer feilsøking.

Den betydelige forskjellen mellom andre CAM kulturmetoder og denne forbedrede kylling CAM kultur metoden er bruk av skreddersydde minireservoarer i xenografting av embryonale nyre…

Materials

Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22×22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610