使用荧光寿命成像在老化C.Elegans中淀粉样蛋白结构的表征
Summary
荧光寿命成像监测器，定量和区分蛋白质在生活、衰老和压力的C.elegans疾病模型中的聚集趋势。
Abstract
淀粉样纤维与一些神经退行性疾病有关，如亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症或阿尔茨海默氏症。这些淀粉样蛋白纤维能隔离内源性转移稳定蛋白以及蛋白酶网络（PN）的成分，从而加剧细胞中的蛋白质错折叠。可用于评估动物体内淀粉样蛋白聚集过程的工具数量有限。我们提出了荧光寿命显微镜（FLIM）的协议，允许监测和定量特定细胞（如神经元）中的淀粉样蛋白纤维化，以非侵入性的方式，随着老化的进展和扰动PN。FLIM 独立于荧光道的表达水平，能够分析聚合过程，而无需任何进一步的染色或漂白。当荧光波在淀粉样结构附近时，荧光波会发出淬火，从而导致荧光寿命的缩短。淬火与淀粉样蛋白的聚合直接相关。FLIM 是一种多功能技术，可应用于以非侵入性方式比较不同淀粉样蛋白、环境刺激或体内遗传背景的纤维化过程。
Introduction
蛋白质聚集发生在衰老和疾病。导致大型淀粉样蛋白或非晶体内含物形成和沉积的路径难以遵循，它们的动力学同样难以解开。蛋白质可能由于编码序列中的内在突变而错折叠，如遗传疾病。蛋白质也折叠不当，因为保持蛋白质解病网络（PN）保持其可溶性和正确折叠是受损的，就像老化期间一样。PN包括分子护护和降解机，负责蛋白质的生物成因、折叠、贩运和降解1。
由于寿命短、等源性以及易于遗传操作，Elegans已成为研究衰老和疾病的模型。几种在脆弱组织中表达人类致病蛋白质的C.elegans转基因菌株已经产生。重要的是，许多含有容易聚集的蛋白质的菌株重述淀粉样蛋白紊乱的特征，即大内含物的形成。多亏了C.elegans的透明身体，这些骨料可以在体内、非侵入性和非破坏性2中可视化。与氟磷融合产生任何感兴趣的蛋白质 （POI） 可以调查其位置、贩运、交互网络和一般命运。
我们通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）来监测生命和衰老C.elegans中致病蛋白的聚集情况。FLIM 是一种基于荧光素寿命的强大技术，而不是其发射光谱。生存期（tau，*）定义为光子从兴奋状态衰减到其接地状态所需的平均时间。给定分子的寿命使用时间相关单光子计数 （TCSPC） 的时域技术计算。在TCSPC-FLIM中，荧光衰减功能是通过用短、高频激光脉冲刺激荧光光，并测量发射的光子到达时间到探测器的脉冲。扫描样本时，会为每个像素创建一个三维数据数组：数组包括有关光子在其x、y空间坐标及其时间衰减曲线中的分布的信息。因此，给定的样本成为揭示蛋白质结构、结合和环境信息,的终身图。每个荧光蛋白都有内在和精确定义的寿命，通常只有几纳秒（ns），取决于其物理化学性质。重要的是，荧光磷的寿命与其浓度、荧光强度和成像方法无关。然而，在生物系统中，它受到环境因素的影响，如pH、温度、电子浓度、氧饱和度及其相互作用伙伴。使用寿命对内部结构变化和方向也十分敏感。将荧光磷与POI融合会导致其寿命发生变化，从而提供有关融合蛋白行为的信息。当荧光波被包围或封装在紧密结合的环境中，如淀粉样蛋白结构的反平行β片时，它非辐射性地失去能量，这个过程称为淬火5。荧光道的淬火导致其明显寿命缩短。当可溶性时，蛋白质的寿命将更接近其原始、更高的价值。相反，当蛋白质开始聚集时，其寿命将不可避免地转移到较低的值66，7。7因此，在活的C.elegans的不同年龄监测任何淀粉样蛋白的聚集倾向成为可能。
在这里，我们描述了一种协议，用于分析融合蛋白的聚合，该蛋白包含不同的多谷氨酰胺（CAG，Q）拉伸（Q40、Q44和Q85）。我们说明了该技术如何同样应用于不同的荧光蛋白，如青色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和单体红荧光蛋白（mRFP）;和在C.elegans的所有组织中，包括神经元、肌肉和肠道。此外，在蛋白酶的上下文中，FLIM是观察分子护工消耗时变化的非常有用的工具。通过RNA干扰击倒关键分子伴之一，热休克蛋白1（hsp-1）会产生蛋白质过早的误折叠。由于老化、疾病或陪护器不足而增加的聚合载荷，然后作为荧光寿命的缩短来衡量。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处介绍的协议描述了一种基于显微镜的技术，用于识别C. elegans模型系统中的聚合物种。FLIM可以通过测量荧光寿命衰变，准确描述融合到荧光磷的聚合和可溶性物种的存在。当融合蛋白开始聚合其记录的平均寿命将从更高值转移到较低的值16。然后，聚合的倾向可以通过寿命的下降来推断：寿命越低，系统中聚合蛋白物种的存在就越高。因此，有可能跟随PN的老化、疾病?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
由国家卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助的CGC提供的肌肉-Q40-mRFP菌株。神经元Q40-CFP是森本实验室的一种礼物。我们承认DFG（KI-1988/5-1到JK，神经Cure博士奖学金由神经Cure卓越集群到MLP），EMBO（短期奖学金MLP）和生物学家公司（旅行赠款CG和MLP）为资助。我们还感谢柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心的高级光显微镜成像设施，该设施为图像 YFP 结构提供了设置。
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
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