형광 일생 화상 진찰을 사용하여 노화 C. Elegans에 있는 아밀로이드 구조물의 특성화
Summary
형광 일생 화상 진찰은 생활, 노화 및 응력 C. elegans 질병 모형에 있는 단백질의 집합 경향을 정량화하고 구별합니다.
Abstract
아밀로이드 섬유소는 헌팅턴병, 파킨슨병 또는 알츠하이머병과 같은 여러 신경 퇴행성 질환과 관련이 있습니다. 이러한 아밀로이드 섬유소는 단백질 성 세포(PN)의 성분뿐만 아니라 내인성 메타안정 단백질을 격리시킬 수 있으며, 이로 인해 세포에서 단백질오폴딩을 악화시킬 수 있다. 동물 내의 아밀로이드 단백질의 응집 과정을 평가하는 데 사용할 수 있는 도구의 수가 제한되어 있습니다. 우리는 뉴런과 같은 특정 세포에서 아밀로이드 섬유의 정량화뿐만 아니라 모니터링을 허용하는 형광 평생 현미경 검사법 (FLIM)에 대한 프로토콜을 비침습적 방식으로, 노화의 진행과 함께 PN. FLIM은 형광단의 발현 수준과 무관하며 더 이상 염색이나 표백없이 응집 과정을 분석할 수 있습니다. 형광광은 아밀로이드 구조의 가까운 곳에 있을 때 담금질되어 형광 수명이 감소합니다. 담금질은 아밀로이드 단백질의 응집과 직접 관련이 있습니다. FLIM은 비침습적 방식으로 생체 내상에서 상이한 아밀로이드 단백질, 환경 자극 또는 유전적 배경의 섬유화 과정을 비교하기 위해 적용될 수 있는 다목적 기술이다.
Introduction
단백질 응집은 노화와 질병 모두에서 발생합니다. 큰 아밀로이드 또는 비정질 개재물의 형성 그리고 증착으로 이끌어 내는 통로는 따르기 어렵고 그들의 역학은 해명하기 위하여 유사하게 도전적입니다. 단백질은 유전 질병의 경우와 같이 코딩 순서 내의 본질적인 돌연변이 때문에 잘못 접을 수 있습니다. 단백질은 또한 그(것)들을 용해하고 제대로 접히지 않는 proteostasis 네트워크 (PN) 노후화 도중 일어나는 것과 같이 손상하기 때문에 잘못 접습니다. PN은 분자 샤페론 및 분해 기계를 포함하고 생물 발생, 접이식, 인신 매매 및 단백질의 분해에 대한 책임이1.
C. 예쁜꼬마선충은 수명이 짧고, 등소성 성질이 나고, 유전적 조작의 용이성으로 인해 노화와 질병을 연구하는 모델로 부상했습니다. 몇몇 C. 예쁜꼬마선충은 취약한 조직에서 인간 질병을 일으키는 단백질을 발현하는 형질전환 균주가 만들어졌습니다. 중요한 것은, 응집되기 쉬운 단백질을 포함하는 많은 균주는 아밀로이드 장애, 큰 개재물의 형성의 특징을 되풀이한다. C. elegans의 투명한 바디 덕분에, 이 응집체는 비침범성 및 비파괴적으로 생체 내에서 가시화될 수 있습니다2. 플루오로포어와 융합하여 관심 있는 단백질(POI)을 생성하면 그 위치, 인신매매, 상호 작용 네트워크 및 일반적인 운명을 조사할 수 있습니다.
우리는 형광 일생 화상 진찰 현미경 검사법 (FLIM)를 통해 생활과 노화 C. elegans에 있는 질병 일으키는 단백질의 집합을 감시하는 프로토콜을 제시합니다. FLIM은 방출 스펙트럼이 아닌 불소의 수명을 기반으로 하는 강력한 기술입니다. 수명(tau, θ)은 광자에서 흥분 상태에서 다시 지면 상태로 붕괴하는 데 필요한 평균 시간으로 정의됩니다. 주어진 분자의 수명은 시간 상관 된 단일 광자 계수 (TCSPC)의 시간 도메인 기술로 계산됩니다. TCSPC-FLIM에서 형광 부패 기능은 짧은 고주파 레이저 펄스로 형광을 흥분시키고 펄스와 관련하여 검출기에 방출된 광자의 도착 시간을 측정하여 얻을 수 있습니다. 샘플을 스캔할 때 각 픽셀에 대해 3차원 데이터 배열이 만들어집니다. x,y 따라서 주어진 샘플은 단백질의 구조, 결합 및 환경3,,4에대한 정보를 공개하는 수명의 지도가 됩니다. 각 형광 단백질은 생리화학적 특성에 따라 본질적으로 정확하게 정의된 수명을 가지고 있으며, 일반적으로 몇 나노초(ns)입니다. 중요한 것은 형광공의 수명은 농도, 형광 강도 및 이미징 방법론과 독립적입니다. 그러나, 생물학적 시스템 내에서, pH, 온도, 이온 농도, 산소 포화도 및 그 상호 작용 파트너와 같은 환경 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 수명은 내부 구조 변경 및 방향에도 민감합니다. POI에 형광포를 융합하면 수명이 변경되고 결과적으로 융합 된 단백질의 거동에 대한 정보가 생성됩니다. 불소가 아밀로이드 구조의 반병렬 베타 시트와 같이 단단히 결합된 환경에서 포위되거나 캡슐화되면, 비방사성으로 에너지를 잃게 되며, 담금질5로알려진 과정이다. 불소의 담금질은 명백한 수명의 단축 귀착됩니다. 용해될 때, 단백질의 수명은 원래의 더 높은 가치에 더 가깝게 유지됩니다. 대조적으로, 단백질이 응집하기 시작하면, 그 수명은 필연적으로 더 낮은 값6,,7로이동합니다. 따라서, 살아있는 C. elegans에있는 다른 나이에 어떤 아밀로이드 형성 단백질의 응집 성향을 감시하는 것이 가능하게 됩니다.
여기서 우리는 상이한 폴리글루타민(CAG, Q) 스트레글(Q40, Q44, 및 Q85)을 포함하는 융합 단백질의 응집을 분석하는 프로토콜을 설명한다. 우리는 기술이 청록색 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 단모공 적색 형광 단백질 (mRFP)과 같은 다른 형광체에 동등하게 적용될 수 있는 방법을 설명합니다; 그리고 C. 예쁜 꼬마의모든 조직에서, 뉴런을 포함, 근육, 그리고 내장. 더욱이, proteostasis의 맥락에서, FLIM은 분자 chaperones의 고갈시 변경을 관찰하는 아주 유용한 공구입니다. RNA 간섭을 통해 주요 분자 샤페론 중 하나인 열 충격 단백질 1(hsp-1)을쓰러뜨리면 단백질의 조기 오인이 발생합니다. 노화, 질병 또는 결핍 된 샤페론의 결과로 응집 부하의 증가는 형광 수명 감소로 측정됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 C. elegans 모형 시스템에서 집계된 종을 확인하기 위하여 현미경 검사법 기지를 둔 기술을 기술합니다. FLIM은 형광 수명 부패의 측정을 통해 형광에 융합된 응집및 수용성 종의 존재를 정확하게 특성화할 수 있습니다. 융합 단백질이 집계되기 시작하면 기록된 평균 수명은 더 높은 값에서 더 낮은값(16)으로이동합니다. 응집의 성향은 다음 수명에 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CGC에 의해 제공되는 근육 Q40-mRFP 긴장, 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무실에 의해 투자되는 (P40 OD010440). 뉴런-Q40-CFP는 모리모토 연구소의 일종의 선물이었습니다. 우리는 DFG를 인정 (JK에 KI-1988/5-1, MLP에 우수성의 NeuroCure 클러스터에 의해 NeuroCure 박사 펠로우십), EMBO (MLP에 단기 펠로우십) 및 생물학자의 회사 (CG와 MLP에 여행 보조금) 자금. 우리는 또한 YFP 구조물을 이미지화하기 위한 설치를 제공하기 위한 베를린 분자 의학을 위한 막스 Delbrück 센터에 있는 고급 빛 현미경 화상 진찰 시설을 인정합니다.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
Riferimenti
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