Характеристика амилоидных структур в старении C. Elegans использованием флуоресценции пожизненной визуализации
Summary
Флуоресценция жизни визуализации мониторов, количественно и отличает агрегации тенденции белков в жизни, старение, и подчеркнул C. elegans модели болезни.
Abstract
Амилоидные фибрилки связаны с рядом нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Гентингтона, Паркинсона или болезнь Альцгеймера. Эти амилоидные фибриллы могут секвестировать эндогенные метастабильные белки, а также компоненты сети протеостаза (PN) и тем самым усугубить неправильное сворачивание белка в клетке. Существует ограниченное количество инструментов для оценки процесса амилоидных белков в животном. Мы представляем протокол для флуоресценции жизни микроскопии (FLIM), что позволяет контролировать, а также количественноать амилоидной фибрилизации в конкретных клетках, таких как нейроны, в неинвазивной образом и с прогрессированием старения и при возмущении PN. FLIM не зависит от уровня экспрессии фторофора и позволяет анализпроцесса агрегации без каких-либо дальнейших окрашивания или отбеливания. Флюорофоры угасают, когда они находятся в непосредственной близости от амилоидных структур, что приводит к снижению срока службы флуоресценции. Закалка напрямую коррелирует с агрегацией амилоидного белка. FLIM является универсальным методом, который может быть применен для сравнения процесса фибрилизации различных амилоидных белков, экологических стимулов, или генетических фонов in vivo в неинвазивной манере.
Introduction
Агрегация белка происходит как при старении, так и при заболеваниях. Пути, которые приводят к образованию и осаждению крупных амилоидов или аморфных включений трудно следовать и их кинетика также сложно разгадать. Белки могут неправильно сложиться из-за внутренних мутаций в их последовательности кодирования, как и в случае генетических заболеваний. Белки также неправильно, потому что протеостаз сети (PN), что держит их растворимыми и правильно сложены нарушается, как это происходит во время старения. PN включает в себя молекулярные сопровождающие и машины деградации и отвечает за биогенез, складные, торговые и деградации белков1.
C. elegans стала моделью для изучения старения и болезней из-за его короткой продолжительности жизни, изогенной природы и простоты генетических манипуляций. Было создано несколько трансгенных штаммов C. elegans, которые выражают белки, вызывающие болезни человека, в уязвимых тканях. Важно отметить, что многие штаммы, содержащие агрегации подверженных белков резюме отличительной чертой амилоидных расстройств, формирование крупных включений. Благодаря прозрачному телу C. elegans, эти агрегаты могут быть визуализированы in vivo, неинвазивно и неразрушительно2. Генерация любого белка, представляющих интерес (POI) в синтезе с фторфором позволяет исследовать его местоположение, торговлю людьми, сеть взаимодействия и общую судьбу.
Мы представляем протокол для мониторинга агрегации болезнетворных белков в жизни и старения C. elegans с помощью флуоресценции визуализации микроскопии (FLIM). FLIM является мощным методом, основанным на жизни фторфора, а не его спектры выбросов. Срок службы (тау, ) определяется как среднее время, требуемое фотоном для распада от возбужденного состояния обратно в его наземное состояние. Срок службы данной молекулы рассчитывается с помощью метода временной домены учета одного фотона (TCSPC). В TCSPC-FLIM функция флуоресцентного распада получается путем захватывающих флюорофора с короткими, высокочастотными лазерными импульсами и измерения времени прибытия испускаемого фотона на детектор по отношению к импульсам. При сканировании образца для каждого пикселя создается трехмерный массив данных: массив содержит информацию о распределении фотонов в их x,y пространственных координатах и кривой временного распада. Таким образом, данный образец становится картой жизней, раскрывающей информацию о структуре белка, связывании и окружающей среде3,,4. Каждый флуоресцентный белок обладает внутренней и точно определенной продолжительности жизни, как правило, в несколько наносекунд (нс), в зависимости от его физиохимических свойств. Важно отметить, что срок службы флюорофора не зависит от его концентрации, флуоресцентной интенсивности и методологии визуализации. Тем не менее, в биологической системе, это может быть влияние экологических факторов, таких как рН, температура, концентрации ионов, насыщение кислородом, и его партнеров взаимодействия. Сроки службы также чувствительны к внутренним структурным изменениям и ориентации. Слияние фторофора с POI приводит к изменению в его жизни и, следовательно, информация о поведении слитого белка. Когда фторофор окружен или инкапсулирован в плотно связанной среде, такой как антипараллельные бета-листы амилоидной структуры, он теряет энергию нерадиационно, процесс, известный как закалка5. Утоления фторофора приводит к сокращению его очевидной жизни. Когда растворимый, срок службы белка будет оставаться ближе к его первоначальной, более высокой стоимости. В отличие от этого, когда белок начинает агрегироваться, его срок службы неизбежно перейдет к более низкому значению6,,7. Таким образом, становится возможным контролировать склонность к агрегации любого амилоидного белка в разном возрасте в живых C. elegans.
Здесь мы описываем протокол для анализа агрегации белка синтеза, состоящего из различных полиглютамин (CAG, No) тянется (No40, No 44, и No 85). Мы иллюстрируем, как этот метод может быть применен в равной степени к различным флуоророромам, таким как циановый флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и мономерный красный флуоресцентный белок (mRFP); и во всех тканях C. elegans, включая нейроны, мышцы и кишечник. Кроме того, в контексте протеостаза, FLIM является очень полезным инструментом для наблюдения за изменениями при истощении молекулярных сопровождающих. Сбив ая расшатывание одного из ключевых молекулярных сопровождающих, белок теплового шока 1(hsp-1),с помощью РНК-интерференции производит преждевременное искажение белков. Увеличение нагрузки агрегации в результате старения, болезни или дефицита сопровождающих, затем измеряется как снижение продолжительности жизни флуоресценции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный здесь протокол описывает метод на основе микроскопии для выявления агрегированных видов в модели системы C. elegans. FLIM может точно охарактеризовать наличие как агрегированных, так и растворимых видов, слитых с фторфором, путем измерения их распада флуоресценции. Когд?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Напряжение мышц-40-mRFP, предоставляемое CGC, которое финансируется NiH Управлением научно-исследовательских инфраструктурных программ (P40 OD010440). Нейрон-40-CFP был добрым подарком лаборатории Моримото. Мы признаем DFG (KI-1988/5-1 в JK, NeuroCure PhD стипендий по NeuroCure кластера передового опыта в MLP), EMBO (краткосрочные стипендии для MLP) и компании биологов (путешествия гранты CG и MLP) для финансирования. Мы также признаем, что центр расширенной световой микроскопии в Центре молекулярной медицины Макса Дельбрюка в Берлине предоставляет установку для изображения, построенного YFP.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
Riferimenti
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging – techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
