Caracterización de estructuras amiloideas en el envejecimiento C. Elegans usando imágenes de por vida de fluorescencia
Summary
La fluorescencia de por vida de los monitores de imágenes, cuantifica y distingue las tendencias de agregación de las proteínas en los modelos de enfermedad de C. elegans, vivos, envejecidos y estresados.
Abstract
Las fibrillas amiloideas están asociadas con una serie de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Huntington, Parkinson o la enfermedad de Alzheimer. Estas fibrillas amiloideas pueden secuestrar proteínas metasógenas endógenas, así como componentes de la red de proteostasis (PN) y así exacerbar el desdoblamiento de proteínas en la célula. Hay un número limitado de herramientas disponibles para evaluar el proceso de agregación de proteínas amiloideas dentro de un animal. Presentamos un protocolo para la microscopía de por vida fluorescencia (FLIM) que permite la monitorización, así como la cuantificación de la fibrilización amiloide en células específicas, como las neuronas, de manera no invasiva y con la progresión del envejecimiento y la perturbación de el PN. FLIM es independiente de los niveles de expresión del fluoróforo y permite un análisis del proceso de agregación sin más tinción o blanqueo. Los fluoróforos se calman cuando se encuentran cerca de estructuras amiloide, lo que resulta en una disminución de la vida útil de la fluorescencia. El temple se correlaciona directamente con la agregación de la proteína amiloide. FLIM es una técnica versátil que se puede aplicar para comparar el proceso de fibrilización de diferentes proteínas amiloideas, estímulos ambientales o fondos genéticos in vivo de una manera no invasiva.
Introduction
La agregación de proteínas ocurre tanto en el envejecimiento como en la enfermedad. Los caminos que conducen a la formación y deposición de grandes amiloides o inclusiones amorfas son difíciles de seguir y su cinética es igualmente difícil de desentrañar. Las proteínas pueden doblarse en sí debido a mutaciones intrínsecas dentro de sus secuencias de codificación, como en el caso de las enfermedades genéticas. Las proteínas también se multiplican por error porque la red de proteostasis (PN) que las mantiene solubles y correctamente plegadas se deteriora, como sucede durante el envejecimiento. El PN incluye chaperones moleculares y maquinarias de degradación y es responsable de la biogénesis, plegado, tráfico y degradación de proteínas1.
C. elegans ha surgido como un modelo para estudiar el envejecimiento y la enfermedad debido a su corta vida útil, naturaleza isogénica y facilidad de manipulación genética. Se han creado varias cepas transgénicas de C. elegans que expresan proteínas causantes de enfermedades humanas en tejidos vulnerables. Es importante destacar que muchas de las cepas que contienen proteínas propensas a la agregación recapitulan el sello distintivo de los trastornos amiloide, la formación de grandes inclusiones. Gracias al cuerpo transparente de C. elegans, estos agregados se pueden visualizar in vivo, no invasiva y no destructivamente2. Generar cualquier proteína de interés (POI) en fusión con un fluoróforo permite investigar sus ubicaciones, tráfico, red de interacción y destino general.
Presentamos un protocolo para monitorear la agregación de proteínas causantes de enfermedades en C. elegans vivo y envejecimiento a través de la microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM). FLIM es una técnica poderosa basada en la vida útil de un fluoróforo, en lugar de sus espectros de emisión. La vida útil (tau, ) se define como el tiempo promedio requerido por un fotón para decaer desde su estado excitado hasta su estado de suelo. La vida útil de una molécula dada se calcula con la técnica de dominio del tiempo del recuento de fotones individuales correlacionados por el tiempo (TCSPC). En TCSPC-FLIM, la función de descomposición fluorescente se obtiene excitando el fluoróforo con pulsos láser cortos y de alta frecuencia y midiendo los tiempos de llegada del fotón emitido a un detector con respecto a los pulsos. Al escanear una muestra, se crea una matriz de datos tridimensional para cada píxel: la matriz incluye información sobre la distribución de los fotones en sus coordenadas espaciales x,y y su curva de decaimiento temporal. Por lo tanto, una muestra determinada se convierte en un mapa de vidas útiles que revela información sobre la estructura, la unión y el entornodela proteína3,4. Cada proteína fluorescente posee una vida útil intrínseca y definida con precisión, generalmente de unos pocos nanosegundos (ns), dependiendo de sus propiedades fisioquímicas. Es importante destacar que la vida útil de un fluoróforo es independiente de su concentración, intensidad fluorescente y de la metodología de imagen. Sin embargo, dentro de un sistema biológico, puede verse afectado por factores ambientales como el pH, la temperatura, las concentraciones ióndas, la saturación de oxígeno y sus socios de interacción. La vida útil también es sensible a los cambios estructurales internos y la orientación. La fusión de un fluoróforo en un PDI da lugar a un cambio en su vida útil y, en consecuencia, a información sobre el comportamiento de la proteína fusionada. Cuando un fluoróforo está rodeado o encapsulado en un entorno estrechamente unido, como las hojas beta antiparalelas de una estructura amiloide, pierde energía de forma no radiativa, un proceso conocido como temple5. El enfriamiento del fluoróforo da como resultado un acortamiento de su vida útil aparente. Cuando es soluble, la vida útil de una proteína se mantendrá más cerca de su valor original y más alto. Por el contrario, cuando una proteína comienza a acumularse, su vida útil inevitablemente cambiará a un valor más bajo6,7. Por lo tanto, se hace posible monitorear la propensión a la agregación de cualquier proteína formador de amiloide a diferentes edades en C. elegans vivos.
Aquí describimos un protocolo para analizar la agregación de una proteína de fusión que comprende diferentes estiramientos de poliglutamina (CAG, Q) (Q40, Q44 y Q85). Ilustramos cómo la técnica se puede aplicar por igual a diferentes fluoróforos, como la proteína fluorescente cian (CFP), la proteína fluorescente amarilla (YFP) y la proteína fluorescente roja monomérica (mRFP); y en todos los tejidos de C. elegans,incluyendo las neuronas, los músculos y el intestino. Además, en el contexto de la proteostasis, FLIM es una herramienta muy útil para observar los cambios en el agotamiento de los chaperones moleculares. Derribar uno de los chaperones moleculares clave, la proteína de choque térmico 1 (hsp-1), a través de la interferencia de ARN produce un desdoblamiento prematuro de las proteínas. El aumento de la carga de agregación como resultado del envejecimiento, la enfermedad o los chaperones deficientes, se mide entonces como una disminución en la vida útil de la fluorescencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí describe una técnica basada en microscopía para identificar especies agregadas en el sistema modelo C. elegans. FLIM puede caracterizar con precisión la presencia de especies agregadas y solubles fusionadas a un fluoróforo a través de la medición de sus desintegraciones de vida útil de fluorescencia. Cuando una proteína de fusión comienza a agregar su vida útil promedio registrada cambiará de un valor más alto a un valor más bajo16. La propensió…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La cepa muscular-Q40-mRFP proporcionada por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de la NIH (P40 OD010440). El neuronal-Q40-CFP fue un regalo amable del Laboratorio Morimoto. Reconocemos la beca DFG (KI-1988/5-1 a JK, NeuroCure PhD por el Clúster de Excelencia NeuroCure a MLP), EMBO (Beca a Corto Plazo a MLP) y la Compañía de Biólogos (becas de viaje a CG y MLP) para financiamiento. También reconocemos el centro de imágenes de microscopía de luz avanzada en el Centro de Medicina Molecular Max Delbrick, Berlín, por proporcionar la configuración para crear una imagen de las construcciones de YFP.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
Riferimenti
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