Screening per fitoestrogeni utilizzando un recettore degli estrogeni a base cellulare β test reporter
Summary
Abbiamo ottimizzato un recettore degli estrogeni disponibile in commercio β reporter per lo screening di alimenti primati umani e non umani per l’attività estrogenica. Abbiamo convalidato questo saggio mostrando che la soia alimentare umana estrogenica nota si registra in alto, mentre altri alimenti non mostrano alcuna attività.
Abstract
Le piante sono una fonte di cibo per molti animali e possono produrre migliaia di sostanze chimiche. Alcuni di questi composti influenzano i processi fisiologici nei vertebrati che li consumano, come la funzione endocrina. I fitoestrogeni, i fitochimici endocrino-attivi più studiati, interagiscono direttamente con l’asse gonadale ipotalamo-ipofisi del sistema endocrino vertebrato. Qui presentiamo il nuovo uso di un saggio a base cellulare per migliorare gli estratti vegetali per la presenza di composti che hanno attività biologica estrogenica. Questo saggio utilizza cellule di mammifero progettate per esprimere altamente il recettore degli estrogeni beta (ERβ) e che sono state trasfette con un gene luciferasi. L’esposizione a composti con attività estrogenica provoca che le cellule producano luce. Questo test è un modo affidabile e semplice per testare l’attività estrogenica biologica. Ha diversi miglioramenti rispetto ai saggi transitori di trasfezione, in particolare la facilità d’uso, la stabilità delle cellule e la sensibilità del saggio.
Introduction
Le piante sono una fonte necessaria di cibo per molti animali, fornendo calorie e sostanze nutritive fondamentali per la sopravvivenza, la riproduzione, la crescita, lo sviluppo e ilcomportamento 1. Le piante producono migliaia di sostanze chimiche, molte delle quali adattamenti per la propria crescita, manutenzione stomatica e riproduzione. Altri composti, considerati metaboliti secondari vegetali (PS), hanno funzioni meno chiare, anche se alcuni sono tossici e probabilmente utilizzati come difesa contro l’erbivoro e il parassitismo (ad esempio, alcaloidi, tannini)2,3. Alcune di queste sostanze chimiche hanno la capacità di influenzare i processi fisiologici a lungo termine negli animali, come il funzionamento endocrino, anche se il motivo per cui questi fitochimici attivi dal punto di vista endocrino interagiscono con il sistema endocrino vertebrato non èancora chiaro 2,4.
I fitoestrogeni, i fitochimici endocrino-attivi più studiati, sono le PS polifenoliche che imitano strutturalmente e funzionalmente gli estrogeni, interagendo direttamente con l’asse gonadale ipotalomo-ipofisario del sistema endocrino vertebrato5. L’ingestione di fitoestrogeni nella dieta umana è associata alla protezione contro alcuni tumori, malattie cardiache e sintomi della menopausa, sebbene altri effetti includano problemi di fertilità. Infatti, gli effetti fisiologici di questi composti sono stati scoperti negli anni ’40 quando l’infertilità negli ovini è stata attribuita al loro pascolo su trifoglio ricco di fitoestrogeni(Trifolium subterrareum)6. Quando ingeriti, i fitoestrogeni possono passare nelle cellule e imitare gli effetti degli estrogeni. Mentre i fitoestrogeni hanno avuto effetti negativi sulla fertilità delle pecore, la relazione tra fitoestrogeni e fisiologia non è semplice. Come le pecore, i rinoceronti bianchi meridionali mostrano sensibilità ai composti estrogenici nei mangimi derivati da elevate quantità di soia e erba medica. Le figlie di femmine nutrite con questa dieta durante la gravidanza hanno meno probabilità di riprodursi7. Tuttavia, altri studi hanno dimostrato che anche i fitoestrogeni possono avere effetti positivi, tra cui la maturazione dei follicoli ovarico neitopi più anziani 8,la prevenzione di alcuni tumori, l’attività antiossidante e gli effetti antiproliferativi9.
L’ampiezza degli effetti dei fitoestrogeni non è sorprendente dato che gli estrogeni influenzano una vasta gamma di funzioni biologiche, tra cui crescita, sviluppo e regolazione del sistema nervoso riproduttivo e centrale10. Sebbene ci siano molti meccanismi di azione, i fitoestrogeni hanno spesso la capacità di modificare, migliorare o interrompere la segnalazione degli estrogeni attraverso la loro capacità di agire come ligandi per i recettori degli estrogeni intranucleari alfa e beta (ERα ed ERβ). Molti fitoestrogeni hanno una struttura ad anello fenolica simile agli estrogeni che consente loro di legare i recettori degli estrogeni. Quelli con attività estrogenica agonistica funzionano come estrogeni, formando un complesso ER-ligando attivato che può dimerizzare e legarsi a un elemento di risposta estrogenica (ERE) e innescare la trascrizione genica11. Pertanto, estrogeni e fitoestrogeni regolano l’attività cellulare e il sistema funziona attraverso le loro azioni come fattori di trascrizione.
Qui presentiamo il nuovo uso di un saggio a base cellulare per migliorare gli estratti vegetali per la presenza di composti che hanno attività biologica estrogenica. Questo saggio utilizza cellule cho dell’ovaio criceto cinese progettate per esprimere molto ERβ, che sono state trasfette con il gene della lucciola (Photinus pyralis) luciferasi collegato a un promotore ERE12. Quando i composti estrogenici sono presenti, si legano al ER, dimerizzano e si legano all’ERE, portando alla trascrizione del gene della luciferasi. Dopo l’aggiunta di una soluzione di substrato, la luciferasi catalizza una reazione che porta all’emissione di fotoni. Pertanto, i campioni positivi producono campioni leggeri e negativi no.
Questo saggio disponibile in commercio elimina la necessità per i laboratori di trasfetto le cellule di mammifero con il gene reporter e il recettore degli estrogeni13,14, che era instabile e variabile nell’efficacia. Il saggio fornisce una piattaforma di trasfezione stabile che consente di determinare rapidamente e semplicemente se una pianta ha attività estrogenica tramite legame del recettore.
Testiamo l’ipotesi che la soia abbia un’attività estrogenica più elevata rispetto a tutti gli altri alimenti date le loro concentrazioni conosciute di isoflavoni estrogenici15 usando alimenti umani di generi alimentari locali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il saggio ERβ reporter sviluppato per lo screening individuale di agenti farmaceutici è adatto anche per lo screening di alimenti vegetali per fitoestrogeni biologicamente attivi attraverso l’ERβ. Importanti considerazioni nel protocollo includono il trattamento dei campioni vegetali con cura: il materiale vegetale fresco deve essere asciugato rapidamente per prevenire lo stampaggio o altre degradazioni biologiche e deve essere tenuto lontano dalla luce per prevenire la fotolisi dei composti18….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati a Dale Leitman per la formazione iniziale nell’uso di saggi transitori di trasfezione per determinare l’attività estrogenica degli alimenti vegetali primati. Grazie a Bradford Westrich e C. Eric Johnson per aver contribuito alla creazione di attrezzature di laboratorio e alla formazione degli studenti sui metodi di estrazione. Infine, grazie all’Università dell’Indiana per aver finanziato questa ricerca.
Materials
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ℃ water bath | |||
| 37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
Riferimenti
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