테라헤르츠 새로 절제된 유방암 종양을 위한 테라헤르츠 이미징 및 특성화 프로토콜
Summary
갓 절제된 인간 유방암 종양은 테라헤르츠 분광법 및 이미징을 특징으로 하며 신선한 조직 처리 프로토콜을 따르게 된다. 조직 포지셔닝은 효과적인 특성화를 가능하게 하는 동시에 향후 수술 중 응용 분야에 대한 적시에 분석을 제공하기 위해 고려됩니다.
Abstract
이 원고는 펄스 테라헤르츠 이미징 및 분광학 기술을 사용하여 갓 절제된 인간 유방 종양을 처리, 특성화 및 이미지화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 정상 발생률에서 테라헤르츠 전송 모드와 30°의 경사 각도에서 테라헤르츠 반사 모드를 포함합니다. 수집된 실험 데이터는 전기장의 시간 도메인 펄스를 나타낸다. 절제된 조직 상에 고정된 점을 통해 전달되는 테라헤르츠 전기장 신호는 분석 모델을 통해 처리되어 조직의 굴절률 및 흡수 계수를 추출합니다. 스테퍼 모터 스캐너를 활용하면, 테라헤르츠 방출 펄스는 종양의 각 픽셀로부터 반사되어 상이한 조직 부위의 평면 이미지를 제공한다. 이미지는 시간 또는 주파수 도메인으로 표시할 수 있습니다. 더욱이, 각 픽셀에서 굴절률 및 흡수 계수의 추출된 데이터는 종양의 토모그래피 테라헤르츠 영상을 제공하기 위해 이용된다. 프로토콜은 암과 건강한 조직 사이의 명확한 분화를 보여줍니다. 한편, 프로토콜을 준수하지 않으면 종양 표면에 기포와 유체가 남아 있기 때문에 시상 또는 부정확한 이미지가 발생할 수 있습니다. 프로토콜은 유방 종양의 외과 마진 평가를 위한 방법을 제공합니다.
Introduction
Terahertz (THz) 화상 진찰 및 분광학은 지난 10년간 연구의 급속하게 증가하는 지역이었습니다. 0.1-4 THz 범위에서 보다 효율적이고 일관된 THz 방출기의 지속적인 개발로 인해1애플리케이션이 크게 1증가했습니다. THz가 약속과 상당한 성장을 보여 준 한 분야는 생물 의학 분야2입니다. THz 방사선은 일반적으로 고정 된 조직을 분석하는 데 사용되는 전력 수준에서 비온화 및 생물학적으로 안전한 것으로 나타났다3. 그 결과, THz 이미징 및 분광법은 화상 손상 및 치유 를 나타내기 위해 수분 함량과 같은 다양한 조직 특징을 분류하고 분화하는 데 사용되어 왔으며4,간 경변증5및 절제 된 조직에서의 암6,,7. 특히 암 평가는 광범위한 잠재적 임상 및 외과 적 적용을 다루며, 뇌의 암에 대해 조사되었으며8,간9,난소10,위장관11,유방7,,12,,13,,14,,15,,16,,17, 18,,18, 19.18,
유방암을 위한 THz 신청은 마진 평가를 통해 유방 보존 수술, 또는 요추 절제술을 지원하는 것에 주로 집중됩니다. 요추 절제술의 목적은 전체 유방 절제술과는 달리 종양과 주변의 건강한 조직의 작은 층을 제거하는 것입니다. 적당한 조직의 외과 마진은 일단 견본이 포르말린에서 고정되고, 절편되고, 파라핀에 매립되고, 현미경 슬라이드에 4 μm-5 μm 조각에 거치되면 병리학을 통해 평가됩니다. 이 과정은 시간이 많이 소요될 수 있으며 양성 마진이 관찰되는 경우 나중에 이차 수술이 필요합니다20. 방사선 종양학의 미국 사회에 의하여 현재 지침은 표면 수준 마진 잉크21를접촉하는 암세포가 있는 것과 같이 이 긍정적인 마진을 정의합니다. 고흡수 수화 조직을 위한 THz 화상 진찰은 급속한 마진 평가의 외과 필요를 충족하기위하여 충분한 조직 모형에 근거를 둔 몇몇 변화하는 침투를 가진 표면 화상 진찰에 1 차적으로 제한됩니다. 수술 설정 중 마진 조건을 빠르게 분석하면 수술 비용과 후속 절차 속도가 크게 감소합니다. 현재까지 THz는 포르말린 고정, 파라핀 내장(FFPE) 조직에서 암과 건강한 조직을 분화하는 데 효과적인 것으로 입증되었지만, 새로 절제된 조직에서 암을 안정적으로 검출하기 위해서는 추가적인 조사가 필요하다7.
이 프로토콜은 바이오뱅크에서 얻은 갓 절제된 인간 조직 샘플에서 THz 이미징 및 분광법을 수행하는 단계를 자세히 설명합니다. 갓 절제된 인간 유방암 조직에 내장된 THz 응용은 특히 병원과 통합되지 않은 연구 집단에 의해 출판된 연구7,,18,,22,,23에서거의 사용되지 않았습니다. 갓 절제된 조직의 사용은 마찬가지로 다른 암 적용에 대해드물며, 대부분의 비유방 인간암 예는 대장암24,,25에대해 보고되고 있다. 이를 위한 한 가지 이유는 FFPE 조직 블록이 연구에 사용되는 THz 시스템이 수술 워크플로우의 일부가 아니라면 갓 절제된 조직보다 접근하고 처리하기가 훨씬 쉽다는 것입니다. 유사하게, 대부분의 상업적인 실험실 THz 시스템은 신선한 조직을 취급하기 위하여 준비되지 않으며, 그 세포주 성장을 사용하는 단계에 아직도 또는 동물 모형에서 절제된 조직을 보기 시작했습니다. 수술 중 설정에 THz를 적용하려면 분석이 표준 병리학을 수행하는 기능을 방해하지 않도록 새로운 조직을 위해 이미징 및 특성화 단계를 사전에 개발해야합니다. 본질적으로 수술 중이 아닌 응용 프로그램의 경우, 신선한 조직의 특성화는 여전히 생체 내 응용 프로그램 및 분화로 작동하기 위해 해결해야하는 도전적인 단계입니다.
이 작업의 목적은 상용 THz 시스템을 사용하여 갓 절제된 조직에 대한 THz 적용에 대한 지침을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 뮤린 유방암 종양13,17,,19에 대한 THz 이미징 및 분광시스템(26)에서 개발되었으며 바이오뱅크26 77,18로부터수득된 인간 수술 조직으로 확장되었다., 프로토콜이 유방암을 위해 생성되는 동안, 성공이 마진 평가27에달려 있는 수술로 취급되는 유사한 THz 화상 진찰 시스템 및 그밖 모형에 적용될 수 있습니다. 갓 절제된 조직에 대한 상당히 적은 양의 THz 결과로 인해, 이것은 THz 이미징 및 특성화를 위한 신선한 조직 취급의 프로토콜에 초점을 맞추는 저자의 지식에 대한 첫 번째 작업입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신선한 조직의 효과적인 THz 반사 이미징은 주로 두 가지 중요한 측면에 의존한다: 1) 조직 취급의 적절한 고려 (섹션 2 및 4.15); 및 2) 스테이지 설정(주로 섹션 4.11). 조직의 불충분 한 건조 증가 반사 및 DMEM 및 다른 액체의 높은 반사로 인해 영역을 시각화 하는 무 능력 귀 착될 수 있다. 한편, 이미징 창과의 조직 접촉이 불량하면 THz 반사 이미지에서 반사가 낮은 반지 나 반점이 생성되어 결과를 모?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 투자 되었다 (NIH) 상 # R15CA208798 그리고 부분적으로 국립 과학 재단에 의해 (NSF) 상 # 1408007. 펄스 THz 시스템에 대한 자금 은 NSF / MRI 상을 통해 얻은 # 1228958. 우리는 NIH 교부금 U42OD11158의 지원으로 국가 질병 연구 교환 (NDRI)에 의해 조달 된 조직의 사용을 인정합니다. 우리는 또한 이 일에서 취급된 모든 조직에 조직 병리학 절차를 수행하기 위한 오클라호마 주립 대학에 오클라호마 동물 질병 진단 실험실과의 협력을 인정합니다.
Materials
| 70% isopropyl alcohol | VWR | 89108-162 | Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water |
| Alconox powder detergent | VWR | 21835-032 | Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass |
| Bio Hazard Bags | Fisher Scientific | 19-033-712 | Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags |
| Cardboard holder | N/A | N/A | Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin |
| Centrifuge Tubes | VWR | 10026-078 | Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line |
| Cotton Swabs | Walmart | 551398298 | Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue |
| Ethyl Alcohol | VWR | 71002-426 | KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol |
| Eye protection goggles | VWR | 89130-918 | Kimberly-clark professional safety glasses |
| Face Mask | VWR | 95041-774 | DUKAL Corporation surgical masks |
| Filter paper | Sigma Aldrich | Z240087 | Whatman grade 1 cellulose filters |
| Formalin solution | Sigma Aldrich | HT501128-4L | 10% neutral buffered formalin |
| Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC)) | National Disease Research Interchange (NDRI biobank | N/A | A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required |
| IRADECON Bleach solution | VWR | 89234-816 | Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution |
| KIMTECH SCIENCE wipes | VWR | 21905-026 | Kimberly-clark professional Kim wipes |
| Laboratory Coat | VWR | 10141-342 | This catalog number is for medium size coat |
| Laboratory tweezers/Forceps | VWR | 82027-388 | Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue |
| Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer) | TeraView, Ltd | N/A | 1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows |
| Nitrile hand gloves | VWR | 82026-426 | This catalog number is for medium size gloves |
| Nitrogen cylinder | Airgas | NI UHP300 | NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300 |
| Paper towel | VWR | 14222-321 | 11 x 8.78" Sheets, 1 Ply |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion. |
| Petri Dish | VWR | 470210-568 | VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom) |
| Polystyrene Plate | Home Depot | 1S11143A | ~ 10 x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet |
| ScanAcquire Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz reflection imaging measurements |
| Stainless steel low-profile blade (#4689) | VWR | 25608-964 | Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades |
| Stainless steel metal tray | Quick Medical | 10F | Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays |
| Tissue Marking Dyes | Ted Pella, Inc | Yellow Dye #27213-1 Red Dye #27213-2 Blue Dye #27213-4 |
Used to orient excised tissue samples sent to the histopathology laboratory |
| TPS Spectra 3000 | TeraView, Ltd | N/A | THz imaging and spectroscopy system |
| TPS Spectra Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz transmission spectroscopy measurements |
Riferimenti
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