Detecção de Proteína S-Acilação usando captura assistida de acila-resina

Summary

A Cil-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) é um método altamente sensível, confiável e fácil de executar para detectar modificações lipídicas reversíveis de resíduos de cisteína (S-acilação) em uma variedade de amostras biológicas.

Abstract

A proteína S-acilação, também referida como S-palmitoylation, é uma modificação pós-translacional reversível de resíduos de cisteína com ácidos graxos de cadeia longa através de uma ligação de tiéster labile. A acilação s, que está emergindo como um mecanismo regulatório generalizado, pode modular quase todos os aspectos da atividade biológica das proteínas, desde a formação complexa até o tráfico de proteínas e a estabilidade proteica. O recente progresso na compreensão da função biológica da proteína S-acilação foi alcançado em grande parte devido ao desenvolvimento de novas ferramentas bioquímicas permitindo a detecção robusta e sensível da proteína S-acilação em uma variedade de amostras biológicas. Aqui, descrevemos a captura assistida por acilina (Acyl-RAC), um método recentemente desenvolvido baseado na captura seletiva de proteínas endógenas S-acylated por contas de Sefarrose reativas de tiol. Em comparação com as abordagens existentes, a Acyl-RAC requer menos passos e pode produzir resultados mais confiáveis quando associada à espectrometria de massa para identificação de novos alvos de acilação S. Uma grande limitação nesta técnica é a falta de capacidade de discriminação entre espécies de ácidos graxos ligadas a cisteínas através da mesma ligação thioester.

Introduction

A s-acilação é uma modificação pós-translacional reversível que envolve a adição de uma cadeia de acila gordurosa a um resíduo de cisteína interna em uma proteína alvo através de uma ligação de thioester labile¹. Foi relatado pela primeira vez como uma modificação de proteínas com palmitato, um ácido graxo saturado de 16^{carbonos 2}, e, portanto, esta modificação é frequentemente referida como S-palmitoylation. Além do palmitato, as proteínas podem ser reversivelmente modificadas por uma variedade de ácidos graxos mais longos e curtos saturados (myristate e esteato), monoinsaturados (oleato) e poliinsaturados (aracidonate e eicosapentanoato) ácidos graxos^3,4,5,6,7. Em células eucarióticas, a s-acilação é catalisada por uma família de enzimas conhecidas como aciltransferases de proteína DHHC e a reação reversa da deacinada cisteína é catalisada por thioesterases protéicas, a maioria das quais ainda permanecem enigmáticas⁸.

A labilidade da ligação tioester torna reversível essa modificação lipídica, permitindo-lhe regular dinamicamente o agrupamento de proteínas, a localização da membrana plasmática, o tráfico intracelular, as interações proteína-proteína e a estabilidade proteica^9,10. Consequentemente, a s-acilação tem sido associada a vários distúrbios, incluindo a doença de Huntington, doença de Alzheimer e vários tipos de câncer (próstata, gástrico, bexiga, pulmão, colorretal), o que requer o desenvolvimento de métodos confiáveis para detectar essa modificação proteica pós-translacional¹¹.

A rotulagem metabólica com palmitato radioativo^([3H], [¹⁴C] ou [¹²⁵I]) foi uma das primeiras abordagens desenvolvidas para ensaio de proteína S-acilação^12,13,14. No entanto, os métodos baseados em rotulagem por radiorotulagem apresentam preocupações de saúde, não são muito sensíveis, demorados e detectam apenas lipidação de proteínas altamente abundantes¹⁵. Uma alternativa mais rápida e não radioativa à rotulagem radioativa é a rotulagem metabólica com sondas de ácidos graxos bioortogonais, que é usada rotineiramente para ensaio dinâmico da proteína S-acilação¹⁶. Neste método, um ácido graxo com um repórter químico (grupo alquina ou azida) é incorporado na proteína S-acylated por uma proteína aciltransferase. A reação de cicloadição de Azide-alquino Huisgen (química do clique) pode então ser usada para anexar um grupo funcionalizado, como um floróforo ou biotina, ao ácido graxo integrado que permite a detecção da proteína S-acylated^17,18,19.

A troca de acilina (ABE) é um dos métodos bioquímicos amplamente utilizados para captura e identificação de proteínas S-acyladas que ignora algumas das deficiências da rotulagem metabólica, como a inadequação para amostras de tecido¹⁵. Este método pode ser aplicado para análise da s-acilação em uma variedade diversificada de amostras biológicas, incluindo tecidos e amostras de células congeladas^20,21. Este método baseia-se no decote seletivo da ligação tioester entre o grupo acile e o resíduo de cisteína por hidroxilamina neutra. Os grupos thiol liberados são então capturados com um derivado de biotina tiol-reativo. As proteínas biotinyladas geradas são então purificadas por afinidade usando agarose de streptavidin e analisadas por imunoblotting.

Uma abordagem alternativa denominada captura assistida de acilina (Acyl-RAC) foi posteriormente introduzida para substituir a etapa de biotinylation por conjugação direta de cisteínas livres por uma resina tiol-reativa^22,23. Este método tem menos passos em comparação com a ABE e da mesma forma pode ser usado para detectar aciação de proteína S em uma ampla gama de amostras¹.

A Cil-RAC consiste em 4 passos principais (Figura 1),
1. Bloqueio de grupos de tiol livres;
2. Decote seletivo da ligação cisteine-acila thioester com hidroxilamina neutra (HAM) para expor grupos de cisteína thiol;
3. Captura das cisteínas lipidados com resina tiol-reativa;
4. Enriquecimento seletivo das proteínas S-acylated após elução com a redução do tampão.

As proteínas capturadas podem então ser analisadas por imunoblotting ou submetidas à espectrometria de massa (MS) para avaliar o proteoma s-acylado em uma variedade variada de espécies e tecidos^22,24,25. Os locais individuais de s-acilação também podem ser identificados pela digestão da tripsina das proteínas capturadas e análise dos peptídeos resultantes por LC-MS/MS²². Aqui, demonstramos como a acil-RAC pode ser usada para detecção simultânea de s-acilação de múltiplas proteínas em uma linha celular e uma amostra de tecido.

Protocol

Os camundongos utilizados neste protocolo foram eutanizados de acordo com as diretrizes do NIH. O Comitê de Bem-Estar Animal do Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas, em Houston, aprovou todo o trabalho animal. 1. Preparação de lysates celulares Prepare o buffer de lysis conforme descrito na Tabela 1. A 10 mL de PBS, adicione 0,1 g de n-dodecil β-D-maltoside detergente (DDM) e gire para dissolver. Adicione 100 μL de coquetel inibidor de fosfatase…

Representative Results

Seguindo o protocolo descrito acima, primeiro usamos acil-RAC para detectar simultaneamente a acilação de S de várias proteínas em células de Jurkat, uma linha de células T imortalizada originalmente derivada do sangue periférico de um paciente com leucemia de células T27. As proteínas de células T regulatórias previamente identificadas como S-acylated9,28,29 foram escolhidas para demonstrar a …

Discussion

Aqui, utilizamos com sucesso o ensaio acil-RAC para detectar a ciação S de proteínas selecionadas em células humanas cultivadas e células primárias derivadas do tecido do camundongo. Este método é simples, sensível e pode ser facilmente realizado com requisitos mínimos de equipamento usando técnicas padrão de bioquímica. Este método tem sido demonstrado para identificar com sucesso novas proteínas S-acylated, como a β-subunidade do sistema de translocação de proteínas (Sec61b), proteína ribossômica S…

Materials

cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets	Sigma	11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	22620444
Hydroxylamine (HAM)	Sigma	159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS)	Sigma	64306
Mini tube rotator	LabForce
ML211	Cayman	17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake	Benchmark Scientific	H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM)	Sigma	D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)	Sigma	T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator	L & R