Nachweis der Protein-S-Acylation mit Acyl-Resin Assisted Capture

Summary

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) ist eine hochempfindliche, zuverlässige und einfach durchzuführende Methode zum Nachweis reversibler Lipidmodifikationen von Cysteinrückständen (S-Acylation) in einer Vielzahl biologischer Proben.

Abstract

Protein-S-Acylation, auch s-palmitoylation genannt, ist eine reversible posttranslationale Modifikation von Cysteinrückständen mit langkettigen Fettsäuren über eine labile Thioesterbindung. Die S-Akylierung, die sich als weitverbreiteter Regulierungsmechanismus herausbildet, kann fast alle Aspekte der biologischen Aktivität von Proteinen modulieren, von der komplexen Bildung bis hin zum Proteinhandel und der Proteinstabilität. Die jüngsten Fortschritte beim Verständnis der biologischen Funktion der Protein-S-Acylation wurden weitgehend durch die Entwicklung neuartiger biochemischer Werkzeuge erzielt, die einen robusten und empfindlichen Nachweis der Protein-S-Acylation in einer Vielzahl biologischer Proben ermöglichen. Hier beschreiben wir acylharzgestützte Erfassung (Acyl-RAC), eine kürzlich entwickelte Methode, die auf der selektiven Erfassung endogen s-acyatierter Proteine durch Thiol-reaktive Sepharose-Perlen basiert. Im Vergleich zu bestehenden Ansätzen benötigt Acyl-RAC weniger Schritte und kann in Verbindung mit der Massenspektrometrie zur Identifizierung neuartiger S-Acylierungsziele zuverlässigere Ergebnisse liefern. Eine wesentliche Einschränkung in dieser Technik ist die mangelnde Fähigkeit, zwischen Fettsäurearten zu unterscheiden, die über die gleiche Thioesterbindung an Cysteins gebunden sind.

Introduction

S-Acylierung ist eine reversible posttranslationale Modifikation, bei der eine fetthaltige Acylkette zu einem internen Cysteinrückstand auf einem Zielprotein über eine labile Thioesterbindung¹verwendet wird. Es wurde zuerst als eine Modifikation von Proteinen mit Palmitat berichtet, eine gesättigte 16-Kohlenstoff-Fettsäure², und daher wird diese Modifikation oft als S-Palmitoylierung bezeichnet. Zusätzlich zu Palmitat können Proteine durch eine Vielzahl von längeren und kürzeren gesättigten (Myristate und Stearat), einfach ungesättigten (Oleat) und mehrfach ungesättigten (Arachidonate und Eicosapentanoat) Fettsäuren^3,4,5,6,7umkehrend modifiziert werden. In eukaryotischen Zellen wird die S-Acylierung von einer Familie von Enzymen katalysiert, die als DHHC-Protein-Acyltransferasen bekannt sind, und die umgekehrte Reaktion der Cystein-Deacylation wird durch Proteinthioesterasen katalysiert, von denen die meisten noch rätselhaft bleiben⁸.

Die Lability der Thioester-Bindung macht diese Lipidmodifikation reversibel, so dass sie Proteinclustering, Plasmamembranlokalisierung, intrazellulären Handel, Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteinstabilität^9,10dynamisch regulieren kann. Folglich wurde die S-Acylierung mit mehreren Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter die Huntington-Krankheit, die Alzheimer-Krankheit und verschiedene Krebsarten (Prostata, Magen, Blase, Lunge, Kolorektal), was die Entwicklung zuverlässiger Methoden zum Nachweis dieser posttranslationalen Proteinmodifikation erfordert¹¹.

Metabolische Etikettierung mit radioaktiver ([³H], [¹⁴C] oder [¹²⁵I]) Palmitat war einer der ersten Ansätze, die entwickelt wurden, um das Protein S-Acylation^12,13,14zu assayieren. Radiolabeling-basierte Methoden stellen jedoch gesundheitliche Bedenken dar, sind nicht sehr empfindlich, zeitaufwändig und erkennen nur lipidation von reichlich vorhandenen Proteinen¹⁵. Eine schnellere und nicht radioaktive Alternative zur Radioetikettierung ist die metabolische Etikettierung mit bioorthogonalen Fettsäuresonden, die routinemäßig zur Untersuchung der Dynamik der Protein-S-Acylation¹⁶verwendet wird. Bei dieser Methode wird eine Fettsäure mit einem chemischen Reporter (Alkyn- oder Azidgruppe) durch eine Proteinacyltransferase in das S-acylolate Protein eingearbeitet. Die Cycloadditionsreaktion Von Azid-Alkyn Huisgen (Klickchemie) kann dann verwendet werden, um eine funktionalisierte Gruppe, wie ein Fluorophor oder Biotin, an die integrierte Fettsäure zu binden, die den Nachweis des S-acyatierten Proteins^17,18,19ermöglicht.

Acyl-Biotin-Austausch (ABE) ist eine der ausgiebig verwendeten biochemischen Methoden zur Erfassung und Identifizierung von S-acyatierten Proteinen, die einige der Mängel der metabolischen Kennzeichnung wie Ungeeignetheit für Gewebeproben¹⁵umgeht. Diese Methode kann für die Analyse der S-Acylation in einer Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich Geweben und gefrorenen Zellproben^20,21, angewendet werden. Diese Methode basiert auf der selektiven Spaltung der Thioesterbindung zwischen der Acylgruppe und dem Cysteinrückstand durch neutrales Hydroxylamin. Die befreiten Thiolgruppen werden dann mit einem Thiol-reaktiven Biotinderivat erfasst. Die erzeugten biotinylierten Proteine werden dann mit Streptavidin-Agarose affinitätsgereinigt und durch Immunoblotting analysiert.

Ein alternativer Ansatz, der als Acyl-Harz-unterstützte Erfassung (Acyl-RAC) bezeichnet wird, wurde später eingeführt, um den Biotinylierungsschritt durch die direkte Konjugation freier Cysteins durch ein Thiol-reaktives Harz zu ersetzen^22,23. Diese Methode hat weniger Schritte im Vergleich zu ABE und kann in ähnlicher Weise verwendet werden, um Protein-S-Acylation in einer Vielzahl von Proben zu erkennen¹.

Acyl-RAC besteht aus 4 Hauptschritten (Abbildung 1),
1. Sperrung freier Thiolgruppen;
2. Selektive Spaltung der Cystein-Acyl-Thioester-Bindung mit neutralem Hydroxylamin (HAM) zur Belichtung von Cystein-Thiol-Gruppen;
3. Erfassung der lipidierten Cysteins mit einem Thiol-reaktiven Harz;
4. Selektive Anreicherung der S-acyatierten Proteine nach Elution mit reduzierendem Puffer.

Die eingefangenen Proteine können dann durch Immunoblotting analysiert oder einer Massenspektrometrie (MS) basierten Proteomik unterzogen werden, um das S-acylierte Proteom in einer Vielzahl von Arten und Geweben zu bewerten^22,24,25. Individuelle S-Acylierungsstellen können auch durch Trypsin-Verdauung der erfassten Proteine und Analyse der resultierenden Peptide durch LC-MS/MS²²identifiziert werden. Hier zeigen wir, wie Acyl-RAC zum gleichzeitigen Nachweis der S-Acylation mehrerer Proteine sowohl in einer Zelllinie als auch in einer Gewebeprobe eingesetzt werden kann.

Protocol

Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurden gemäß den NIH-Richtlinien eingeschläfert. Das Animal Welfare Committee am University of Texas Health Science Center in Houston genehmigte alle Tierarbeiten. 1. Herstellung von Zelllysaten Vorbereiten des Lysepuffers wie in Tabelle 1beschrieben . Auf 10 ml PBS 0,1 g n-Dodecyl-D-Maltosid-Waschmittel (DDM) geben und drehen, um sich aufzulösen. Fügen Sie 100 l Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2, ML211 (10 m), PM…

Representative Results

Nach dem oben beschriebenen Protokoll verwendeten wir zunächst Acyl-RAC, um gleichzeitig die S-Acylierung mehrerer Proteine in Jurkat-Zellen zu erkennen, einer verewigten T-Zelllinie, die ursprünglich aus dem peripheren Blut eines T-Zell-Leukämiepatienten abgeleitet wurde27. Regulatorische T-Zellproteine, die zuvor als S-acylatierte9,28,29 identifiziert wurden, wurden ausgewählt, um den Nutzen dieser …

Discussion

Hier haben wir den Acyl-RAC-Assay erfolgreich genutzt, um die S-Acylierung ausgewählter Proteine sowohl in kultivierten menschlichen Zellen als auch in Primärzellen aus Mausgewebe zu erkennen. Diese Methode ist einfach, empfindlich und kann mit minimalen Ausrüstungsanforderungen mit Standard-Biochemie-Techniken einfach durchgeführt werden. Diese Methode hat sich gezeigt, um erfolgreich neuartige S-acylated Proteine wie die Untereinheit des Protein-Translocating-Systems (Sec61b), das ribosomale ProteinSS11 (R…

Materials

cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets	Sigma	11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	22620444
Hydroxylamine (HAM)	Sigma	159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS)	Sigma	64306
Mini tube rotator	LabForce
ML211	Cayman	17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake	Benchmark Scientific	H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM)	Sigma	D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)	Sigma	T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator	L & R