Påvisning af Protein S-Acylation ved hjælp af Acyl-Resin Assisted Capture

Summary

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) er en meget følsom, pålidelig og nem at udføre metode til at opdage reversibel lipid ændring af cysteinrester (S-acylation) i en række biologiske prøver.

Abstract

Protein S-acylation, også kaldet S-palmitoyrlation, er en reversibel posttranslationel ændring af cysteinrester med langkædede fedtsyrer via en labile thioester-binding. S-acylation, der er ved at opstå som en udbredt reguleringsmekanisme, kan modulere næsten alle aspekter af proteiners biologiske aktivitet, fra kompleks dannelse til proteinhandel og proteinstabilitet. De seneste fremskridt med hensyn til forståelse af protein S-acylations biologiske funktion blev opnået i vid udstrækning på grund af udviklingen af nye biokemiske værktøjer, der muliggør robust og følsom påvisning af protein S-acylation i en række biologiske prøver. Her beskriver vi acyl harpiks-assisteret fangst (Acyl-RAC), en nyligt udviklet metode baseret på selektiv indfangning af endogent S-acylated proteiner ved thiol-reaktiv sepharose perler. Sammenlignet med eksisterende tilgange kræver Acyl-RAC færre trin og kan give mere pålidelige resultater, når det kombineres med massespektrometri til identifikation af nye S-acylationsmål. En væsentlig begrænsning i denne teknik er den manglende evne til at skelne mellem fedtsyrearter knyttet til cysteiner via samme thioester obligation.

Introduction

S-acylation er en reversibel posttranslationel modifikation, der indebærer tilsætning af en fedtacylkæde til en intern cysteinrest på et målprotein via en labile thioester-binding¹. Det blev først rapporteret som en ændring af proteiner med palmitat, en mættet 16-carbon fedtsyrer², og derfor denne ændring er ofte omtalt som S-palmitoyrlation. Ud over palmitat kan proteiner ændres reversibelt ved en række længere og kortere mættede fedtsyrer (myristat og stearate), enkeltumættede (oleate) og flerumættede fedtsyrer (arachidonate og eicosapentanoate) fedtsyrer^3,4,5,6,7. I eukaryote celler katalyseres S-acylation af en familie af enzymer kendt som DHHC protein acyltransferases, og den omvendte reaktion af cysteindeacylation katalyseres af proteinthioesterases, hvoraf de fleste stadig er gådefulde⁸.

Labiliteten af thioester binding gør denne lipid modifikation reversibel, gør det muligt at dynamisk regulere protein klyngedannelse, plasma membran lokalisering, intracellulær handel, protein-protein interaktioner og protein stabilitet^9,10. Derfor har S-acylation været forbundet med flere lidelser, herunder Huntingtons Sygdom, Alzheimers sygdom og flere former for kræft (prostata, gastrisk, blære, lunge, kolorektal), hvilket kræver udvikling af pålidelige metoder til at opdage denne post-translationelle protein modifikation¹¹.

Metabolisk mærkning med radioaktivt ([³H], [¹⁴C] eller [¹²⁵I]) palmitat var en af de første metoder udviklet til analyseprotein S-acylation^12,13,14. Men, radiomærkning-baserede metoder udgør sundhedsmæssige bekymringer, er ikke meget følsomme, tidskrævende, og kun opdage lipidation af meget rigelige proteiner¹⁵. Et hurtigere og ikke-radioaktivt alternativ til radioaktiv mærkning er metabolisk mærkning med bioortogonale fedtsyresonder, som rutinemæssigt anvendes til analysedynamik af protein S-acylation¹⁶. I denne metode, en fedtsyre med en kemisk reporter (alkyne eller azide gruppe) er indarbejdet i S-acylated protein ved et protein acyltransferase. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaktion (klik kemi) kan derefter bruges til at knytte en funktionaliseret gruppe, såsom en fluorophore eller biotin, til den integrerede fedtsyre giver mulighed for påvisning af S-acylated protein^17,18,19.

Acyl-biotin udveksling (ABE) er en af de udbredte biokemiske metoder til indfangning og identifikation af S-acylated proteiner, der omgår nogle af manglerne ved metabolisk mærkning såsom uegnet til vævsprøver¹⁵. Denne metode kan anvendes til analyse af S-acylation i en bred vifte af biologiske prøver, herunder væv og frosne celleprøver^20,21. Denne metode er baseret på selektiv spaltning af thioesterbindingen mellem acylgruppen og cysteinrester ved neutral hydroxylamin. De befriede thiol grupper er derefter fanget med en thiol-reaktiv biotin derivat. De genererede biotinylated proteiner er derefter affinitet-renset ved hjælp af streptavidin agarose og analyseret ved immunblotting.

En alternativ tilgang, der kaldes acyl-harpiks assisteret fangst (Acyl-RAC), blev senere indført for at erstatte biotinylation-trinnet med direkte konjugering af frie cysteiner med en thiolreaktiv harpiks^22,23. Denne metode har færre trin sammenlignet med ABE og kan ligeledes bruges til at detektere protein S-acylation i en lang række prøver¹.

Acyl-RAC består af 4 hovedtrin (figur 1),
1. Blokering af frie thiol grupper;
2. Selektiv spaltning af cystein-acyl thioester obligation med neutral hydroxylamin (HAM) for at afsløre cystein thiol grupper;
3. Indfangning af lipidatiserede cysteiner med en thiol-reaktiv harpiks;
4. Selektiv berigelse af S-acylaterede proteiner efter eluering med reducerende buffer.

De tilfangetagne proteiner kan derefter analyseres ved immunblotting eller udsat for massespektrometri (MS) baseret proteomics at vurdere S-acylated proteom e i en varieret vifte af arter og væv^22,24,25. Individuelle S-acylation steder kan også identificeres ved trypsin fordøjelse af de tilfangetagne proteiner og analyse af de resulterende peptider ved LC-MS/MS²². Her demonstrerer vi, hvordan acyl-RAC kan bruges til samtidig påvisning af S-acylation af flere proteiner i både en cellelinje og en vævsprøve.

Protocol

Mus, der anvendes i denne protokol blev aflivet i henhold til NIH retningslinjer. Animal Welfare Committee ved University of Texas Health Science Center i Houston godkendte alt dyrearbejde. 1. Fremstilling af cellelysater Klargør lysisbufferen som beskrevet i tabel 1. Til 10 ml PBS tilsættes 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside vaskemiddel (DDM) og roteres for at opløse. Der tilsættes 100 μL fosfatasehæmmercocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) og proteasehæmmerco…

Representative Results

Efter den protokol, der er beskrevet ovenfor, vi første gang brugt acyl-RAC til samtidig at opdage S-acylation af flere proteiner i Jurkat celler, en udødeliggjort T-celle linje oprindeligt stammer fra det perifere blod af en T-celle leukæmi patient27. Regulatoriske T-celleproteiner, der tidligere var identificeret som S-acylateret9,28,29, blev valgt for at påvise nytten af denne metode., Som vist i <…

Discussion

Her har vi med succes udnyttet acyl-RAC-analysen til at detektere S-acylation af udvalgte proteiner i både dyrkede humane celler og primære celler afledt af musevæv. Denne metode er enkel, følsom og kan nemt udføres med minimale udstyrskrav ved hjælp af standardbiokemiteknikker. Denne metode har vist sig at kunne identificere nye S-acylaterede proteiner såsom β-subenheden i proteintranslokaliseringssystemet (Sec61b), ribosomprotein S11 (Rps11) og mikrosomal glutathion-S-transferase 3 (MGST3)<sup class="x…

Materials

cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets	Sigma	11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	22620444
Hydroxylamine (HAM)	Sigma	159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS)	Sigma	64306
Mini tube rotator	LabForce
ML211	Cayman	17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake	Benchmark Scientific	H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM)	Sigma	D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)	Sigma	T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator	L & R