상기 프로토콜은 꾸준한 대용량 에어로졸 전달(예를 들어, 생체내 흡입 연구)에 적합한 다종 액체 용액으로부터 제어된 에어로졸의 연속 생산을 위한 모세관 에어로졸 발생기의 설정 및 사용을 기술한다.
모세관 에어로졸 발생기 (CAG)는 초기 단계에서 전자 액체의 가열을 통한 열 액체 증발의 원리로 작동되고, 이어서 핵 형성 및 응축 조절에 의해 기류의 혼합물을 통해 조절되어 전자 담배 (EC)에서와 같은 에어로졸을 생성한다. CAG는 EC의 사용이 가능하지 않은 생체 내 흡입 독성학 연구와 같은 예를 들어 연속 방식으로 대량의 에어로졸을 생성하는 데 특히 유용합니다. CAG에서 에어로졸을 생성하는 열 효과는 EC에 적용되는 온도 측면에서 유사하므로 조사관이 전자 액체의 증기를 규모와 재현성으로 평가할 수 있습니다. CAG의 작동으로 사용자는 전자 액체의 유량, 가열 온도 및 희석 공기 흐름과 같은 중요한 매개 변수를 제어 할 수 있으므로 조사관은 잘 제어 된 장치에서 다양한 전자 액체 제형을 테스트 할 수 있습니다. 에어로졸 입자 크기와 같은 특성은 e-액체 유동 및 e-액체 조성물에 대하여 공기 유량으로 조절되는 것으로 입증된다. 그러나 CAG는 요소의 과열과 같은 일반적인 EC 관련 문제를 평가하는 데 제한적입니다. 우리는 CAG가 선택한 전자 액체 제형으로 화학적 및 물리적 에어로졸 특성을 평가함으로써 재현 가능하고 지속적인 에어로졸을 생성 할 수 있음을 입증하고자합니다. 이 프로토콜은 생체 내 독성학 연구에 필요한 에어로졸 농도 및 입자 크기를 최적화하는 데 필요한 액체 유량, 희석 공기 유량 및 작동 절차의 작동 매개 변수를 설명합니다. 프로토콜의 대표적인 결과를 제시하고 CAG 작업의 과제와 응용 프로그램에 대해 논의함으로써 CAG를 재현 가능한 방식으로 사용할 수 있음을 보여줍니다. 이전 작업에서 개발 된 기술과 프로토콜은 실험실 제어 에어로졸 생성 조사를위한 미래 혁신의 토대가됩니다.
일반적인 전자 액체는 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 물, 니코틴 및 선택된 향료의 혼합물을 함유한다. EC 장치에서 생성 된 에어로졸의 조성은 액체 제형뿐만 아니라 장치의 재료, 설계 및 특성에 달려 있습니다. 결과적으로, 많은 EC 장치는 원치 않는 구성 요소의 상승된 수준의 장치 별 생산, 퍼프 부피 변화, 차단 된 환기 구멍으로 인한 공기 흐름의 변화 및 “건식 퍼핑”(액체 용기가 거의 비어있을 때 전달 된 에너지의 일부가 액체 증발에 사용되지 않기 때문에 장치의 과열을 일으키는 경우)2을 포함하여 에어로졸 출력1에 큰 변동성을 도입 할 수 있습니다. . 또한 장기 흡입 연구 중에 EC 장치를 충전, 리필 및 청소하는 것은 물류 측면에서 큰 추가 제약 조건이 될 것입니다3. 이러한 이유로 에어로졸 발생기는 에어로졸의 대규모 생산 및 액체 제형의 적절한 평가를 위해 고려되어야하며 에어로졸 조성의 장치 관련 변동을 피하고 작업 부하 4,5를 줄여야합니다. 그럼에도 불구하고 장치 생성 에어로졸은 EC 장치의 특정 구성 요소의 수준이 장치 6,7,8의 가열 / 냉각 특수성으로 인해 실험실에서 제어되는 표준화 된 에어로졸 발생기의 수준보다 더 높을 수 있기 때문에 위험 평가 전략의 일부로 남아 있어야합니다.
현재 이용 가능한 규제 요구 사항에 대한 제한된 정보로 인해 전자 담배 (EC)에 의해 생성 된 에어로졸의 잠재적 독성에 대한 평가 방법은 여전히 9,10,11 진화하고 있습니다. 그러나, 정확한 시험관내 및 생체내 평가는 시간이 지남에 따라 잘 특성화되고 재현가능한 부피의 에어로졸의 생성을 필요로 한다. 제어 된 퍼핑 요법으로 EC 장치에서 에어로졸을 생산하는 것은 확실히 사용자 소비의 관점에서 가장 대표적인 과정입니다. 규제 독성 연구의 경우, 사용자가 종종 스스로 준비 할 수있는 다양한 가능한 액체 제형을 고려하고 동시에 일부 장치 특성 (예 : 전달 된 에너지)을 수정하면 장기간 반복 노출 독성학 연구를 수행하기위한 EC 장치의 사용은 도전적일뿐만 아니라 잠재적으로 부적절합니다.
필립 모리스 (Philip Morris) 12,13에 의해 개발되고 버지니아 커먼 웰스 대학 (Virginia Commonwealth University) 14에 의해 더욱 정제 된 모세관 에어로졸 발생기 (CAG)는 전기적으로 가열 된 모세관에서 뜨거운 증기 흐름의 제트기를 만드는 원리에 따라 작동하며, 이는 이후 주변 공기로 냉각되어 입자 핵 형성 및 후속 응축을 일으켜 에어로졸 형성을 유도합니다. 동일한 물리적 공정이 EC에서 에어로졸 형성을 유도하기 때문에 (CAG의 펌프에 의해 액체를 모세관으로 전달하는 것 외에도 EC에서는 일반적으로 EC의 저장소에서 액체를 인출하는 위킹 재료에 작용하는 모세관력으로 대체됩니다), CAG에서 생성 된 에어로졸의 특성은 EC 에어로졸14의 특성과 매우 유사합니다 (그림 1 ). CAG는 취급 요구 사항이 거의없는 대량의 에어로졸을 생산할 수 있습니다. 따라서, 생체내 흡입 연구에 특히 적합하다.
CAG는 연동 펌프를 통해 온도 조절기 및 액체 저장소에 간단히 연결된 가열 모세관 튜브로 구성된 실험실 장치입니다(그림 2A). 모세관(160mm, 21G, 스테인리스강)은 모두 알루미늄 블록에 내장된 네 개의 발열체로 가열됩니다(그림 2B). 온도는 전형적으로 EC 장치(15)의 코일-가열 조건을 모방하기 위해 250-275°C로 설정된다. 모세관을 통해 펌핑된 액체는 가열되어 모세관의 끝에서 나오는 뜨거운 증기로 변합니다. CAG 어셈블리(그림 2C)에는 생성된 증기를 차가운 공기와 혼합하고 에어로졸을 형성하기 위한 추가 요소가 필요합니다. 뜨거운 과포화 증기와 차가운 공기 흐름의 갑작스런 혼합은 핵화 및 후속 응축을 초래하여 에어로졸 형성을 초래합니다 (그림 2C). CAG 설계(그림 3)에서 추가적인 가열된 공기 흐름은 먼저 외부 본체를 냉각시키고 그 후에 가열 블록을 따라 순환하여 공기 흐름을 가열하여 모세관 끝에서 액체 역류의 응축을 방지하고 증기 제트 파열을 안정화합니다. 또한, 그것은 뜨거운 증기의 원치 않는 차폐를 생성하여 핵 형성 과정에 영향을 미칩니다. 이러한 이유로, 이 공기 흐름에 적용되는 유량은 최소한이어야 하며 적용 목적에 맞아야 합니다. 이 공기 흐름은이 원고 전체에서 “가열 된 공기 흐름”이라고하지만,이 흐름은 사용자가 의도적으로 가열하지 않고 가열 블록에 의해 수동적으로 가열된다는 것을 이해해야합니다.
냉각 기류 속도는 생성 된 에어로졸 입자의 크기에 강한 영향을 미칩니다. 생체내 흡입 연구를 위한 에어로졸 생산에서, 희석 공기 흐름은 노출 용량을 결정할 것이고, 노출 챔버에 도달하기 전에 추가로 희석되어야 할 수도 있다. 에어로졸의 화학적 조성 외에도, 생성 된 에어로졸이 ECs에 의해 생성 된 것과 유사하고 OECD 가이드 라인에 의해 권장되는 흡입 입자 크기 범위 내에 있는지 확인하기 위해 에어로졸 입자 크기 분포 (PSD)를 특성화하는 것이 필수적입니다 (종종 질량 중앙값 공기 역학 직경 [MMAD] 및 기하학적 표준 편차 [GSD]를 가진 PSD의 로그 정상성의 가정에 의해 매개 변수화됨).
생성된 에어로졸의 MMAD는 장치 설계, 제형의 물리화학적 액체 특성(예를 들어, 밀도, 점도 및 표면 장력), 공기 유량, 및 열역학적 조건(14,16,17)을 지시하는 온도에 따라 광범위하게 변할 수 있다. 생체내 노출 실험의 경우, 기류는 일반적으로 22± 2°C에서 조건화되고 여과된 공기와 5% 상대 습도± 60%로 구성됩니다. 생성 된 에어로졸은 연구 요구 사항에 따라 추가로 희석되어 시험 분위기에서 목표 농도를 달성 할 수 있습니다. 그런 다음 여과 손실을 줄이기 위해 유리 배관을 통해 노출 챔버로 전달됩니다. 여기에 제시된 결과에서, 온도 및 기류 설정은 CAG가 생체내 흡입 연구를 위해 일관되고 흡입 가능한 PSD 및 정의된 농도를 갖는 제어된 에어로졸의 연속 생산에 사용될 수 있음을 입증하기 위해 확립된다.
프로토콜에서는 1) CAG를 조립하고, 2) CAG에서 에어로졸을 생성하는 데 필요한 매개 변수를 결정하고, 3) 에어로졸 생성을 수행하고, 4) 에어로졸에서 관심있는 물리적 및 화학적 구성 요소를 분석하는 방법을 설명합니다. 이러한 예비 실행을 위해, 우리는 에어로졸 형성 성분의 혼합물에 기초한 액체 용액을 고려합니다 : 프로필렌 글리콜 (PG), 글리세롤 (VG), 물 및 니코틴은 규정 된 질량 분율에서. 마지막으로, 우리는 실험에서 생성 된 복잡한 다종 혼합물의 평가를위한 예제 데이터를 공유 할 것입니다 (위에서 언급 한 성분과 추가 향미 성분이 혼합 된 구성 요소를 포함). 우리는 이러한 혼합물의 평가에 대한이 실험 접근법의 적용 가능성과 함께 전반적인 결과와 도전에 대해 논의 할 것입니다.
CAG로 에어로졸을 생성하면 EC 장치 특정 에어로졸화 공정의 변동성을 줄여 에어로졸화된 전자 액체 제형 자체에 대한 객관적이고 제어 가능한 평가를 가능하게 합니다. CAG 생성 에어로졸은 ECs7에 의해 생성된 에어로졸을 대표하는 것으로 나타났습니다. 이들은 동일한 조성 및 특성으로 재현가능하게 생성될 수 있고, 따라서, 장기간에 걸쳐 다량의 에어로졸을 필요로 하는 생체내 장기 노출 연구에 특히 적합하다8.
CAG 설정은 조립이 비교적 간단하고 유지 보수가 쉽습니다. 그러나 액체 유량 및 각 공기 유량과 같은 작동 매개 변수는 CAG 생성 에어로졸의 적용 목적에 따라 방법 최적화가 필요한 제어 에어로졸의 생산에 여전히 중요합니다.
현재 연구에서 제시된 결과는 냉각 기류 속도가 에어로졸 입자 크기 분포에 명확한 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 냉각 공기 흐름은 생성 된 에어로졸이 흐르는 내부 튜브의 냉각으로 인해 생성 된 증기의 핵화뿐만 아니라 응축에도 직접적인 영향을 미칩니다. 또한, 조밀 한 에어로졸은 실질적인 응고 효과가있는 경향이 있습니다. 결합, 이러한 과정은 복잡하며 에어로졸 형성에 대한 상호 작용과 영향은 특정 전자 액체, 온도 및 흐름에 대해 일반화하기가 다소 어렵습니다. 보충 기류 조성물 (상대 습도의 고정 된 비율로 건조 또는 가습)-특히 수분 함량 -은 열 및 질량 교환에 영향을 미쳐 에어로졸 입자의 응축 성장뿐만 아니라 벽 응축을 유도합니다. 따라서, 이 방법의 파라미터에 대한 수정은 PSD(17,19)를 제어하는 측면에서 사용의 목적으로 간주된다.
용해도가 낮거나 끓는점이 높은 화학 물질의 존재는 모세관 내 침전과 시간이 지남에 따라 모세관의 막힘으로 인해 CAG 생성 에어로졸의 효과를 제한 할 수 있습니다. 에어로졸에 존재하는 화학 물질에 따라 CAG를 작동시키는 온도를 조정하여 증기를 생성해야합니다. 또한, 액체 제형의 안정성은 정기적으로 평가되어야 한다. 상이한 비등점을 갖는 향미제를 포함하는 구성성분의 첨가는 최종 에어로졸 조성물(14 ) 및 기액 분할에 영향을 미칠 것이다. 고온 모세관 근처의 역류 및 액체 침착을 방지하기 위해 모세관 온도 및 가열 기류를 조정해야 할 수도 있으며, 이는 고온에서 액체의 체류 기간이 길기 때문에 열 분해의 제어되지 않은 제품 (예 : 카르보닐)이 생성 될 수 있습니다. 또한, 모세관에서 증기를 발생시키기 위해 사용되는 온도를 제어하면 모세관 내에서 증기가 형성되기 시작하는 곳-온도가 높을수록 증기가 더 일찍 형성되는 곳에 영향을 미친다. 모세관 온도가 높을수록, 모세관에서 나오는 증기는 냉각 공기 흐름에 의해 냉각되는 데 더 오래 걸릴 것이고, 따라서, 핵을 형성하기 시작하고 모세관 팁으로부터 더 멀리 떨어진 에어로졸로 응축되기 시작하여, 역류 효과(19)를 피하도록 돕는다.
현재의 전자 액체 생체 내 독성학 연구는 OECD TG 413 연구20에서와 같이 요구되는 에어로졸의 규모를 충족시키기 위해 물류 복잡성으로 인해 전자 담배 에어로졸을 재생하는 데 한계가 있습니다. 이 연구에서 제시된 프로토콜은 필립 모리스 인터내셔널에서 생체 내 장기 노출 연구18에서 에어로졸 생성을 위해 사용되는 CAG 어셈블리 및 설정에 대한 개요를 제공합니다. 이들 데이터는 다른 실험실 환경(예를 들어, 약물 전달 시스템(21))에서 추가적인 미세 조정을 위한 또는 특정 연구의 특정 요건에 적응하기 위한 좋은 출발점으로서 작용할 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
Aluminium front cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | B-505432 | 2 x |
Aluminium rear cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Cambridge glass filter pads | GE Healthcare UK Limited | 9703-9654 | 44 mm diameter |
Capillary 21 G SS, 160 mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | 304H21RW | 1 x |
Dry wipes | Contec Inc. , SC, USA | Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol | cleaning material |
Flowmeter | TSI, Shoreview, MI, USA | 4100 Series, 0-20 L/min | or equivalent |
Gilibrator-2 calibrator | Sensidyne, St-Petersburg FL, USA | Gilian Gilibrator-2 | Air flow calibrator |
Glass Couplings | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | |
Glass piping | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | Pipe 25 and 40 mm |
Heating elements | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | LDC01864 | 4 x |
High heat grease | Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA | High temperature multipurpose grease | CAG maintenance |
Inner PEEK tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Magnetic stirrer | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany | C-MAG HS 4 | or equivalent |
Micro impingers | Labo Service, Kontich, Belgium | Custom Built | |
Outer SS tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
PEEK adaptor | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Peristaltic pump | Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK | Watson-Marlow 530 U | or equivalent |
Push-in fitting | Festo Pte Ltd | NPQM-DK-M5-Q4-P10 | 1 x |
Sample Column Extrelut NT3 cartridge | Merk Sigma-Aldrich | 115095 | |
SS 25 mm assembly cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
SS M8 lead screw | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS M8 nut | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS rear backing | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Temperature controller | Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Digi-Sense TC 9600 | or equivalent |
Thermocouple type K | RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland | 814-0147 | 1 x |