Il protocollo descrive le impostazioni e l’uso di un generatore di aerosol capillare per la produzione continua di aerosol controllato da una soluzione liquida multispecie, adatta per la somministrazione costante di aerosol di grandi volumi (ad esempio, studi di inalazione in vivo ).
Il generatore di aerosol capillare (CAG) viene azionato con il principio di evaporazione termica del liquido attraverso il riscaldamento dell’e-liquid nella fase iniziale, seguito da nucleazione e condensazione regolate attraverso una miscela di flusso d’aria per generare aerosol, come in una sigaretta elettronica (EC). Il CAG è particolarmente utile per generare aerosol di grandi volumi in modo continuo, per casi come studi tossicologici per inalazione in vivo , in cui l’uso di EC non è fattibile. Gli effetti termici della generazione di aerosol dal CAG sono simili in termini di temperatura applicata in una CE, consentendo così agli investigatori di valutare i vapori degli e-liquid su scala e riproducibilità. Poiché il funzionamento del CAG consente agli utenti di controllare parametri critici come la portata dell’e-liquid, le temperature di riscaldamento e i flussi d’aria di diluizione, consente agli investigatori di testare varie formulazioni di e-liquid in un dispositivo ben controllato. Le proprietà, come la dimensione delle particelle di aerosol, hanno dimostrato di essere regolate con la portata d’aria rispetto al flusso di e-liquid e alla composizione dell’e-liquid. La CAG, tuttavia, è limitata nel valutare le questioni comuni relative alla CE, come il surriscaldamento dei suoi elementi. Cerchiamo di dimostrare che il CAG può generare aerosol riproducibile e continuo, valutando le caratteristiche chimiche e fisiche dell’aerosol con una formulazione e-liquid scelta. Il protocollo descrive i parametri operativi della portata del liquido, delle portate dell’aria di diluizione e delle procedure operative necessarie per ottimizzare la concentrazione di aerosol e la dimensione delle particelle necessarie per uno studio tossicologico in vivo . Presentando i risultati rappresentativi del protocollo e discutendo le sfide e le applicazioni del lavoro con un CAG, dimostriamo che CAG può essere utilizzato in modo riproducibile. La tecnologia e il protocollo, che sono stati sviluppati da lavori precedenti, servono come base per le future innovazioni per le indagini sulla generazione di aerosol controllate in laboratorio.
Gli e-liquid comuni contengono una miscela di glicole propilenico, glicerolo, acqua, nicotina e aromi selezionati. La composizione di un aerosol generato da un dispositivo EC dipende non solo dalla formulazione liquida, ma anche dal materiale, dal design e dalle caratteristiche del dispositivo. Di conseguenza, molti dispositivi EC possono introdurre una grande variabilità nella produzione di aerosol1, compresa la produzione specifica del dispositivo di livelli elevati di costituenti indesiderati, variazione del volume del soffio, variazione del flusso d’aria dovuta a fori di ventilazione bloccati e “soffio a secco” (quando il contenitore del liquido è quasi vuoto, causando il surriscaldamento del dispositivo perché parte dell’energia erogata non viene utilizzata per l’evaporazione del liquido)2 . Inoltre, la ricarica, la ricarica e la pulizia dei dispositivi EC durante gli studi di inalazione a lungo termine diventerebbero un enorme vincolo aggiuntivo in termini di logistica3. Per questi motivi, altri generatori di aerosol dovrebbero essere presi in considerazione per la produzione su larga scala di aerosol e una corretta valutazione delle formulazioni liquide, evitando variazioni legate al dispositivo nella composizione dell’aerosol e diminuendo il carico di lavoro 4,5. Tuttavia, gli aerosol generati dai dispositivi dovrebbero rimanere parte delle strategie di valutazione del rischio, poiché i livelli di alcuni componenti nei dispositivi CE potrebbero essere più elevati di quelli dei generatori di aerosol standardizzati controllati in laboratorio a causa delle specificità di riscaldamento/raffreddamento dei dispositivi 6,7,8.
A causa delle limitate informazioni sui requisiti normativi attualmente disponibili, i metodi di valutazione per la potenziale tossicità degli aerosol generati dalle sigarette elettroniche (CE) sono ancora in evoluzione 9,10,11. Tuttavia, un’accurata valutazione in vitro e in vivo richiede la generazione di volumi di aerosol ben caratterizzati e riproducibili nel tempo. Produrre aerosol da un dispositivo CE con un regime di soffiaggio controllato sarebbe certamente il processo più rappresentativo dal punto di vista del consumo dell’utente. Per gli studi di tossicità regolamentare, considerando una varietà di possibili formulazioni liquide che gli utenti possono spesso preparare da soli e, allo stesso tempo, modificando alcune caratteristiche del dispositivo (ad esempio, l’energia erogata), l’uso di dispositivi CE per l’esecuzione di studi tossicologici a esposizione ripetuta a lungo termine non è solo impegnativo ma anche potenzialmente inadeguato.
Il generatore di aerosol capillare (CAG) – sviluppato da Philip Morris12,13 e ulteriormente perfezionato dalla Virginia Commonwealth University14 – funziona sul principio di creare un getto di flusso di vapore caldo da un capillare riscaldato elettricamente, che viene successivamente raffreddato con aria ambiente, causando la formazione di nucleo di particelle e la successiva condensazione, portando alla formazione di aerosol. Poiché gli stessi processi fisici portano alla formazione di aerosol nelle CE (a parte l’erogazione del liquido al capillare da parte di una pompa nel CAG, che, in una CE, viene solitamente sostituita da forze capillari che agiscono sul materiale traspirante che preleva il liquido dal serbatoio nella CE), le caratteristiche degli aerosol generati da CAG sono molto simili a quelle degli aerosol CE14 (Figura 1 ). Il CAG consente la produzione di grandi volumi di aerosol, con pochi requisiti di movimentazione; è quindi particolarmente adatto per studi inalatori in vivo.
Il CAG è un dispositivo da laboratorio costituito da un tubo capillare riscaldato semplicemente collegato a un regolatore di temperatura e a un serbatoio di liquido tramite una pompa peristaltica (Figura 2A). Il capillare (160 mm, 21 G, acciaio inossidabile) è riscaldato da quattro elementi riscaldanti, tutti incorporati in un blocco di alluminio (Figura 2B). La temperatura è in genere impostata a 250-275 °C per imitare le condizioni di riscaldamento della bobina di un dispositivo EC15. Il liquido pompato attraverso il capillare viene riscaldato e trasformato in vapore caldo che esce dalla punta del capillare. L’assemblaggio CAG (Figura 2C) richiede elementi aggiuntivi per miscelare il vapore generato con aria fredda e formare un aerosol. La brusca miscelazione del vapore caldo supersaturo con un flusso d’aria fredda provoca la nucleazione e la successiva condensazione, portando alla formazione di aerosol (Figura 2C). Nel nostro progetto CAG (Figura 3), un ulteriore flusso d’aria riscaldata raffredda prima il corpo esterno e successivamente circola lungo i blocchi riscaldanti per riscaldare il flusso d’aria, impedendo, allo stesso tempo, la condensazione del riflusso liquido sulla punta del capillare e stabilizzando lo scoppio del getto di vapore. Inoltre, crea una schermatura indesiderata dei vapori caldi, influenzando così il processo di nucleazione. Per questo motivo, la portata applicata per questo flusso d’aria dovrebbe essere minima e adattarsi allo scopo dell’applicazione. Questo flusso d’aria sarà chiamato “flusso d’aria riscaldato” in tutto questo manoscritto, anche se deve essere chiaro che questo flusso viene riscaldato passivamente dai blocchi riscaldanti e non di proposito dall’utente.
La portata d’aria di raffreddamento ha una forte influenza sulla dimensione delle particelle di aerosol generate. Nella produzione di aerosol per studi di inalazione in vivo , il flusso d’aria di diluizione determinerà la dose di esposizione e potrebbe dover essere ulteriormente diluito prima di raggiungere la camera di esposizione. Oltre alla composizione chimica degli aerosol, è essenziale caratterizzare la distribuzione granulometrica dell’aerosol (PSD) per garantire che l’aerosol generato sia simile a quello generato dalle CE e all’interno dell’intervallo di dimensioni delle particelle per inalazione raccomandato dalle linee guida dell’OCSE (spesso parametrizzato dall’ipotesi di log-normalità della PSD con diametro aerodinamico mediano di massa [MMAD] e deviazione geometrica standard [GSD]).
L’MMAD degli aerosol generati può variare ampiamente a seconda del design del dispositivo, delle proprietà fisico-chimiche liquide della formulazione (ad esempio, densità, viscosità e tensione superficiale), della portata d’aria e della temperatura che detta le condizioni termodinamiche 14,16,17. Per gli esperimenti di esposizione in vivo, il flusso d’aria è generalmente costituito da aria condizionata e filtrata a 22 ± 2 °C e 60% ± 5% di umidità relativa. L’aerosol generato può quindi essere ulteriormente diluito a seconda delle esigenze dello studio, per raggiungere le concentrazioni target nell’atmosfera di prova. Viene quindi consegnato tramite tubazioni di vetro alla camera di esposizione al fine di ridurre la perdita di filtrazione. Nei risultati qui presentati, le impostazioni di temperatura e flusso d’aria sono stabilite per dimostrare che il CAG può essere utilizzato per la produzione continua di un aerosol controllato con PSD coerente e inalabile e concentrazioni definite per studi di inalazione in vivo.
Nel protocollo, descriveremo come: 1) assemblare il CAG, 2) determinare i parametri necessari per generare aerosol dal CAG, 3) eseguire la generazione di aerosol e 4) analizzare i costituenti fisici e chimici di interesse per l’aerosol. Per queste serie preliminari, consideriamo una soluzione liquida basata su una miscela di componenti che formano aerosol: glicole propilenico (PG), glicerolo (VG), acqua e nicotina alle frazioni di massa prescritte. Infine, condivideremo dati di esempio per la valutazione di una miscela multispecie complessa generata nei nostri esperimenti (che coinvolge i suddetti costituenti mescolati con componenti aromatici aggiuntivi). Discuteremo i risultati e le sfide complessive insieme all’applicabilità di questo approccio sperimentale per la valutazione di tali miscele.
La generazione di aerosol con CAG aiuta a ridurre la variabilità dei processi di aerosolizzazione specifici del dispositivo EC, consentendo una valutazione obiettiva e controllabile della formulazione e-liquid aerosolizzata stessa. Gli aerosol generati da CAG hanno dimostrato di essere rappresentativi degli aerosol generati da EC7. Possono essere generati in modo riproducibile con la stessa composizione e caratteristiche e sono quindi particolarmente adatti per studi di esposizione a lungo termine in vivo che richiedono grandi volumi di aerosol per un lungo periodo di tempo8.
La configurazione CAG è relativamente semplice da assemblare e facile da mantenere. Tuttavia, i parametri operativi, come la portata del liquido e le rispettive portate d’aria rimangono fondamentali per la produzione di aerosol controllato, che richiede l’ottimizzazione del metodo in base allo scopo di applicazione dell’aerosol generato da CAG.
I risultati presentati nel presente studio mostrano che la velocità del flusso d’aria di raffreddamento ha un chiaro effetto sulla distribuzione delle dimensioni delle particelle di aerosol. Il flusso d’aria di raffreddamento ha un impatto diretto non solo sulla nucleazione dei vapori generati ma anche sulla condensazione, a causa del raffreddamento del tubo interno in cui scorre l’aerosol generato. Inoltre, l’aerosol denso è soggetto a sostanziali effetti di coagulazione. Combinati, questi processi sono complessi e la loro interazione e influenza sulla formazione di aerosol sono piuttosto difficili da generalizzare per gli specifici e-liquid, temperature e flussi. La composizione supplementare del flusso d’aria (secco o umidificato con una percentuale fissa di umidità relativa), in particolare il contenuto di acqua, influenzerà il calore e lo scambio di massa, portando non solo alla crescita modulata della condensazione delle particelle di aerosol, ma anche alla condensazione delle pareti. Pertanto, le modifiche ai parametri di questo metodo sono considerate ai fini dell’uso in termini di controllo della PSD 17,19.
La presenza di sostanze chimiche con bassa solubilità o alti punti di ebollizione potrebbe limitare l’efficacia dell’aerosol generato da CAG a causa della precipitazione all’interno del capillare e dell’intasamento del capillare nel tempo. A seconda delle sostanze chimiche presenti nell’aerosol, la temperatura per il funzionamento del CAG deve essere regolata per generare il vapore. Inoltre, la stabilità della formulazione liquida deve essere valutata regolarmente. L’aggiunta di costituenti, compresi gli aromi, con diversi punti di ebollizione avrà un’influenza sulla composizione finale dell’aerosol14 e sulla partizione gas-liquido. Potrebbe essere necessario adattare la temperatura capillare e il flusso d’aria di riscaldamento per prevenire il riflusso e la deposizione di liquidi vicino al capillare caldo, che potrebbe comportare la generazione di prodotti incontrollati di degradazione termica (come i carbonili) a causa della lunga durata di ritenzione del liquido ad alta temperatura. Inoltre, il controllo della temperatura utilizzata per generare il vapore nel capillare ha un impatto su dove il vapore inizia a formarsi nel capillare: maggiore è la temperatura, prima si forma il vapore. Con una temperatura capillare più elevata, il vapore che esce dal capillare impiegherà più tempo per essere raffreddato dal flusso d’aria di raffreddamento e, quindi, inizierà a nucleare e condensarsi in un aerosol più lontano dalla punta capillare, contribuendo a evitare un effetto di riflusso19.
Gli attuali studi tossicologici in vivo sugli e-liquid sono limitati nella riproduzione di aerosol di sigarette elettroniche a causa della complessità logistica per soddisfare la scala di aerosol richiesta, come in uno studio dell’OCSE TG 41320. Il protocollo presentato in questo studio fornisce una panoramica sull’assemblaggio CAG e sulle impostazioni utilizzate da Philip Morris International per la generazione di aerosol negli studi di esposizione a lungo termine in vivo 18. Questi dati possono servire come un buon punto di partenza per un’ulteriore messa a punto in un altro ambiente di laboratorio (ad esempio, sistemi di somministrazione di farmaci21) o per l’adattamento a requisiti specifici di un particolare studio.
The authors have nothing to disclose.
Aluminium front cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | B-505432 | 2 x |
Aluminium rear cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Cambridge glass filter pads | GE Healthcare UK Limited | 9703-9654 | 44 mm diameter |
Capillary 21 G SS, 160 mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | 304H21RW | 1 x |
Dry wipes | Contec Inc. , SC, USA | Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol | cleaning material |
Flowmeter | TSI, Shoreview, MI, USA | 4100 Series, 0-20 L/min | or equivalent |
Gilibrator-2 calibrator | Sensidyne, St-Petersburg FL, USA | Gilian Gilibrator-2 | Air flow calibrator |
Glass Couplings | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | |
Glass piping | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | Pipe 25 and 40 mm |
Heating elements | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | LDC01864 | 4 x |
High heat grease | Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA | High temperature multipurpose grease | CAG maintenance |
Inner PEEK tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Magnetic stirrer | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany | C-MAG HS 4 | or equivalent |
Micro impingers | Labo Service, Kontich, Belgium | Custom Built | |
Outer SS tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
PEEK adaptor | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Peristaltic pump | Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK | Watson-Marlow 530 U | or equivalent |
Push-in fitting | Festo Pte Ltd | NPQM-DK-M5-Q4-P10 | 1 x |
Sample Column Extrelut NT3 cartridge | Merk Sigma-Aldrich | 115095 | |
SS 25 mm assembly cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
SS M8 lead screw | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS M8 nut | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS rear backing | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Temperature controller | Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Digi-Sense TC 9600 | or equivalent |
Thermocouple type K | RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland | 814-0147 | 1 x |