На месте Гибридизация для Sipunculus nudus Coelomic жидкости
Summary
Этот протокол описывает эффективный подход к гибридизации на месте для определения уровней экспрессии мРНК и пространственных моделей генов-мишеней в коеломной жидкости Sipunculus nudus.
Abstract
На месте гибридизация (ISH) является очень информативным методом представления клеточных моделей распределения конкретных генов (например, мРНК и ncRNA) в тканях. Сипункулидный червь Sipunculus nudus является важнейшим рыбным ресурсом, поскольку он имеет высокие питательные и лекарственные значения. В настоящее время исследования молекулярной биологии Sipunculus nudus все еще находятся в зачаточном состоянии. Целью данной статьи является разработка чувствительного метода локализации специфической мРНК в сипункулусе нудуса-келомической жидкости. Протокол включает в себя подробные шаги ISH, в том числе digoxigenin помечены антисмысл и смысл riboprobe подготовки, coelomic сбора жидкости и подготовки секции, конкретные гибридизации рибозонда, инкубации антител, окраски и пост-окраски лечения. Доказаны репрезентативные результаты успешного эксперимента с использованием этого метода. Протокол должен быть применим и к другим видам Сипункулы.
Introduction
ISH, используя помеченные нуклеиновой кислоты зонд для обнаружения конкретной ДНК или РНК последовательность интересов, является полезным методом для описания пространственной экспрессии картины генов-мишеней в морфологически сохраненныхтканей 1,2,3. Как правило, целевая последовательность генерируется полимеразной цепной реакцией (ПЦР), а затем используется в качестве шаблона для синтеза антисмыслового/чувстве РНК-зонда, помеченного дигоксигенином моридином-5′-трифосфатом. Образцы фиксируются и пронизаны перед инкубации с помощью рибозаза. После смыва избыточного зонда, гибридизация визуализируется иммуногистохимией с помощью антидигоксигенина антитела, которое щелочной фосфатазы-конъюгированных3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; заказ Sipunculida: Sipunculidae) является unsegmented, coelomate и двусторонним симметричным морским червем7,8. Sipunculus nudus является космополитическим видом, широко распространенным в тропических и умеренных прибрежных водах. Он также является важным морским промысловым ресурсом на юге Китая из-за его высокой питательной и целебной ценности9,,10. Тем не менее, Sipunculus nudus в молекулярной биологии все еще находится в зачаточном состоянии. Чтобы в полной мере понять биологическую роль генов, большой интерес представляет исследование моделей экспрессии генов в клеточном разрешении. В немодельном организме Sipunculus nudusметод ISH, который является идеальным методом обнаружения моделей экспрессии генов, до сих пор не установлен. Его кельомная жидкость содержит несколько типов клеток, в том числе гранулоциты, клетки урны, пузырькулярные клетки, зародышевые клетки, эритроциты и т.д.11. Двойной секс / mab-3 связанных транскрипции фактор-1(dmrt1), используется в качестве репрезентативного гена в этом методе, является весьма сохранены транскрипции регулятора определения пола и дифференциации в большинстве видов, начиная от беспозвоночных для млекопитающих12,13. В целом ряде видов (нат., черный порги и т.д.) 14, dmrt1 был выражен в клетках Sertoli, окружающих зародышевые клетки, функция которых похожа на трофобластные клетки Sipunculus nudus. Поэтому мы предположили, что dmrt1 из Sipunculus nudus выражается в трофобластных клетках сперматозiii,-и результат метода ISH четко подтвердил гипотезу.
Этот протокол впервые описывает ISH, с digoxigenin помечены антисмысл / смысл мРНК зондов, чтобы определить мРНК экспрессии моделей в его coelomic мазка жидкости. Обеспечиваются оптимальные условия реакции, которые позволяют очень чувствительновую визуализацию экспрессии мРНК в высоком разрешении. Разработанный метод ISH потенциально может быть применен в более sipunculida видов, кроме Sipunculus nudus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предыдущие исследования показали, что ISH подходит для обнаружения нескольких целевых РНК16,,17,,18. В этом протоколе мы описали метод ISH высокого разрешения для обнаружения мРНК в коеломической жидкости и акцента на оптимизированные услов…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом молодых ученых Национального фонда естественных наук Китая (Грант No 31801034), Фондом естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (2016J01161), Научно-исследовательскими фондами Университета Хуацяо (15BS306) и Инновационным фондом аспирантов в области научных исследований Университета Хуацяо.
Materials
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
Riferimenti
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O’Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
